2016 年里約奧運會(huì )的開(kāi)幕式上，超模吉賽爾·邦臣一襲銀衣氣場(chǎng)全開(kāi)的走秀震撼了全世界，吉娘娘美得讓人窒息！一日，某小博對著(zhù)吉娘娘的時(shí)尚硬照冒「星星眼」時(shí)，突然想——我的免疫熒光樣本如何拍的像吉娘娘一樣 「美艷不可方物」呢？
小博同學(xué)仔細回顧了以前做過(guò)的片子，閉關(guān)參悟苦心求索，終于頓悟：
免疫熒光要拍好，模 (yàng) 特 (běn) 顏 (zhuàng) 值 (tài) 是訣竅。
先天得有好容貌，后 (miǎn) 天 (yì) 化 (rǎn) 妝 (sè) 更重要！
通過(guò)免疫熒光對樣本進(jìn)行染色，整個(gè)流程和化妝（護膚、妝前乳、底妝、彩妝，和定妝）一樣，有五個(gè)步驟。免疫熒光染色是如何一步步實(shí)現「化妝」的呢？小博同學(xué)下面會(huì )一一分解（藍孩子們，聽(tīng)到「化妝」不要打瞌睡嘛，這可是關(guān)乎你們畢業(yè)大計的寶貴知識哦）。
「基礎護膚」--固定樣本
和基礎護膚的目的一樣，固定的目的就是為了長(cháng)久保持細胞的狀態(tài)，讓樣本「容顏永駐」，「宛如生時(shí)」。
通過(guò)化學(xué)試劑處理樣本，從而固定細胞結構和蛋白分布。免疫熒光的固定劑可以分為交聯(lián)類(lèi)固定劑和有機溶劑類(lèi)固定劑。交聯(lián)類(lèi)固定劑大多采用的是甲醛、多聚甲醛等醛類(lèi)物質(zhì)，這一類(lèi)固定劑通過(guò)醛基與蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)反應，形成網(wǎng)絡(luò )，保持蛋白質(zhì)的位置和結構，是最常用的固定劑。在少數情況下，可能會(huì )用到有機溶劑類(lèi)固定劑，如甲醇、丙酮等。它們是通過(guò)變性蛋白質(zhì)的方式對組織進(jìn)行固定。具體使用何種樣本固定劑，可查看特定的抗體說(shuō)明書(shū)。（圖 1）
圖 1. 經(jīng)優(yōu)化的固定劑顯著(zhù)改善免疫熒光染色效果
「妝前乳」——通透細胞膜
固定好樣本的「容貌」之后，為了幫助「化妝品」進(jìn)入細胞，貼合抗原，需要進(jìn)行細胞膜通透的步驟。
通透，就是在細胞膜上打孔，使封閉液和抗體能夠進(jìn)入細胞。一般情況下，采用醛類(lèi)固定劑固定的樣本需通透細胞膜，而有機溶劑類(lèi)固定劑本身就可以通透細胞膜，固定后的細胞不需要再增加通透步驟。通透一般采用表面活性劑 Triton-XTM 100，少數情況下，采用甲醇作為通透劑會(huì )得到更好的染色效果?？贵w說(shuō)明書(shū)上會(huì )標注出合適的通透劑。（圖 2）
圖 2. 甲醇通透改善了某些胞內蛋白的染色效果
「底妝」——封閉抗體非特異性結合位點(diǎn)
「底妝」是為了遮蓋皮膚的瑕疵，保證后續「妝容」的清爽干凈。免疫熒光里，抗體的非特異性結合會(huì )導致樣本的「妝容」出現瑕疵，需要用「封閉液」上點(diǎn)「底妝」「遮瑕」——封閉掉非特異性結合位點(diǎn)。封閉液一般采用與二抗同來(lái)源的血清。
作為「底妝」的封閉液雖然常常扮演幕后英雄的角色，不引人注意，但是，如果封閉液質(zhì)量不好，孵育抗體之后很可能出現很多雜點(diǎn)，輕則影響美觀(guān)，重則掩蓋抗體的特異性信號，毀掉整個(gè)免疫熒光樣本。而 Troubleshooting 的時(shí)候往往會(huì )先從抗體上找原因，兜兜轉轉換了好多抗體也得不到滿(mǎn)意的結果，白白浪費很多時(shí)間。所以，不要小看「底妝」對「妝容」的影響，慎選封閉液才能保證「妝容」通透干凈。
「彩妝」——孵育一抗/二抗、細胞核復染
經(jīng)過(guò)前面一系列的處理，我們的「模特」已經(jīng)擁有了無(wú)瑕的美肌。下面，讓我們期待「模特」的「彩妝」大變身。
化妝時(shí)，需「彩妝」修飾妝容，免疫熒光中，則是用抗體標記樣本的特點(diǎn)，并添加絢麗的色彩。其中，一抗用來(lái)識別樣本中的抗原，定位「彩妝」，二抗用來(lái)放大信號、增加色彩。
一抗
一抗決定「彩妝」的定位，其特異性和靈敏度是免疫熒光成功與否的關(guān)鍵。如果一抗靈敏度不高，不能體現樣本的「上妝」效果，如果特異性不強，「妝容」就會(huì )臟兮兮的，哪哪兒都是。更有特異性差的抗體，明明應該識別核蛋白，卻在胞質(zhì)里玩的不亦樂(lè )乎，使整個(gè)熒光結果「面目全非」。
去哪里才能找到最合適免疫熒光一抗呢？小博經(jīng)過(guò)多年苦心驗證，吐血推薦 CST?。?！這里的抗體質(zhì)量穩定，靈敏度高、特異性強，是免疫熒光成功的不二法門(mén)。（圖 3）
圖 3.CST 的抗體在免疫熒光中比競爭者有更好的特異性。
圖 4. 直標熒光一抗可實(shí)現同種屬來(lái)源一抗的雙染。
二抗
有的一抗偶聯(lián)了熒光基團，可以直接為免疫熒光的樣本提供絢麗的色彩（圖 4）。但是更多的情況下，一抗不帶有熒光標記，需要偶聯(lián)熒光基團的二抗與一抗結合，放大樣本信號，并且添加耀眼的「彩妝」效果（圖 5）。
圖 5. 用熒光二抗進(jìn)行雙染。
選擇二抗時(shí)除了要與一抗匹配之外，還要考慮熒光基團的顏色、穩定性等因素對成像效果的影響。
1）熒光基團的顏色：每一個(gè)熒光基團都有它特定的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，選擇熒光基團的時(shí)候，既要考慮實(shí)驗的需求，也要考慮顯微鏡的光源和濾光片配置。常見(jiàn)熒光基團的激發(fā)光和發(fā)射光如下（表 1）所示：
表 1. 常用熒光基團及對應激發(fā)光發(fā)射光。
2）熒光基團的穩定性：熒光基團長(cháng)時(shí)間暴露在光下（尤其是顯微鏡的汞燈、激光器等強光源下），容易發(fā)生淬滅。好不容易做好的片子，剛剛在顯微鏡下調好視野準備拍照，熒光信號就淬滅了，這種感覺(jué)就好像花了一早晨時(shí)間畫(huà)了個(gè)美美的妝，結果剛出門(mén)就趕上一場(chǎng)大雨，「脫妝」了，實(shí)在太讓人沮喪了。
為了防止「脫妝」，建議選用 Alexa Fluor??系列或 DyLight??系列的熒光基團標記的抗體。這類(lèi)熒光基團具有更強的信號強度，更好的光穩定性，耐受更廣泛的 pH 范圍，可以很好地減少熒光淬滅。目前，CST 用于免疫熒光的二抗，都是 Alexa Fluor??系列基團標記的。
細胞核復染
用抗體對樣本上完「彩妝」之后，還可以復染細胞核對「妝容」進(jìn)行修飾。復染的染料也有多種選擇（表 2）。
復染可以在二抗孵育后單獨進(jìn)行，也可以采用含有 DAPI 的封片劑直接封片 (#8961)，省略單獨復染的步驟。
表 2. 常用熒光核酸染料及對應激發(fā)光發(fā)射光。
「定妝」——封片
「彩妝」上完后，不要著(zhù)急進(jìn)影棚拍片，還需上點(diǎn)「定妝液」，防止「脫妝」。
免疫熒光樣本的「定妝液」是防熒光淬滅的封片液，當然推薦 CST 的 ProLong?? Gold Antifade Reagent (#8961，#9071)，它對熒光淬滅具有很好的抑制效果，可以保持「彩妝」持久靚麗。使用這種封片液時(shí)，蓋好蓋玻片后記得將載玻片放在黑暗處固化 24 hr，達到最佳的防淬滅效果。之后，就可以涂上美美的指甲油進(jìn)行封片啦。（圖 6）
圖 6. ProLong? Gold Antifade Reagent 可以長(cháng)時(shí)間保持免疫熒光效果。
以上，就是一個(gè)樣本小「模特」成功進(jìn)階為免疫熒光界的「吉賽爾·邦臣」的「化妝」大法，有了美艷的「超?！?，再配上一點(diǎn)點(diǎn)拍照技巧，您期待的「美艷不可方物」的免疫熒光大片就呼之欲出了。
（本文轉載丁香通）
