化學(xué)發(fā)光免疫分析放射免疫分析法有很高的靈敏度，但存在著(zhù)放射性防護和同位素污染等問(wèn)題。近年來(lái)，許多非放射性同位素標記的免疫分析方法相繼出現。其中，在化學(xué)發(fā)光反應及抗原-抗體特異性識別基礎上建立起來(lái)的一種新的非放射免疫分析技術(shù)--化學(xué)發(fā)光免疫分析法，由于這種方法具有靈敏度高，特異性強，精密度好，線(xiàn)性范圍寬，儀器設備簡(jiǎn)單，試劑價(jià)格低廉，方法穩定、快速等優(yōu)點(diǎn)，已成為一種重要的非同位素標記免疫分析方法，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、脂肪酸、維生素和藥物等的檢測。
化學(xué)發(fā)光免疫分析包括三大類(lèi)型：即標記化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的化學(xué)發(fā)光免疫分析；標記熒光物質(zhì)的熒光化學(xué)發(fā)光免疫分析和標記酶的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析。下面以偶合放大化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析法檢測人血清中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)為例。

      (一)　原理

      盡管辣根過(guò)氧化物酶(HRP)可以催化Luminol-H２O２反應體系產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，但由于該體系的檢測靈敏度不夠高，不能滿(mǎn)足酶聯(lián)免疫測定的要求。因此，為了提高體系的檢測靈敏度，可將HRP催化H２O２氧化曙紅(Eosin)的反應與該反應產(chǎn)物增強HRP催化luminol-H２O２的化學(xué)發(fā)光反應相偶合，建立偶合放大化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析法。這里，酶的活性是基于下列發(fā)光反應進(jìn)行檢測的:

      HRP
      luminol＋H２O２───→產(chǎn)物＋hν

      產(chǎn)　物

      ↑ 
Eosin＋H２O２ ──────┘HRP

      （二)　操作步驟

      1.　包被抗體　在每個(gè)小試管中加入聚苯乙烯珠各一枚，再加入300μl用0.05M,PH9.6 碳酸鹽緩沖液稀             釋的抗HBsAg抗體，同時(shí)設空白對照，置4℃過(guò)夜。

      2.　洗滌　用抽濾針頭吸干管內液體，加入Tris-HCl-Tween20洗滌3次，每次加2ml，放置3～5min，用抽濾針頭吸干管內液體。

      3.　加待檢血清和陽(yáng)性標準品　用PBS-Tween20緩沖液不同倍數稀釋HBsAg陽(yáng)性標準品或待檢血清,每管加入300μl。同時(shí)設陰性對照;空白對照管只加抗體稀釋液。置37℃孵育2h。

      4.　洗滌　同2。

      5.　加酶標抗體　 用含小牛血清的PBS-Tween20緩沖液稀釋HRP標記的抗HBsAg抗體，每管加入300μl，空白對照管只加用于稀釋酶標抗體的稀釋液。置37℃孵育2h。

      6.　洗滌　同2。

      7.　化學(xué)發(fā)光測定　給每管加入300μl底物溶液，置37℃保溫20min。犎;后將小試放入LKB-1250 lumimeter中，并置于測量位置，加入300μl 5.0×10－４M luminol。記錄儀記錄化學(xué)發(fā)光強度。

      8.　同時(shí)用ELISA方法進(jìn)行對照，結果測量采用DG3022型酶聯(lián)免疫檢測儀。

      結果判定

      (1)　定性　按下列公式判別陰、陽(yáng)性:



L樣品－L空白　　　　 ┌≥2.1　為陽(yáng)性
S／N ＝ ────────?。健∩泰?/span>
L陰性對照－L空白　　　 └＜2.1　為陰性



      (2)　定量　以不同稀釋度的HBsAg陽(yáng)性標準品的化學(xué)發(fā)光強度為縱坐標，不同稀釋倍數為橫坐標，作出劑量反應曲線(xiàn)(標準曲線(xiàn))，犜r待測樣品中HBsAg的含量就可由測量的化學(xué)發(fā)光強度換算得到。

      (三)　試劑和器材

      1.　試劑

      (1)　緩沖液　a.　0.05M, PH9.6 Na２CO３-NaHCO３緩沖液(包被液)

b. 0.01M, PH7.4 PBS-Tween20緩沖液(抗體稀釋液)

c. 0.02M, PH7.4 Tris-HCl-Tween20緩沖液(洗滌液)

      (2)　抗體　　a. 抗HBsAg抗體

b. HRP標記的抗HBsAg抗體

      (3)　抗原　　a. 正常人血清(HBsAg陰性對照)

      b. HBsAg陽(yáng)性標準品

      c. 待檢血清
      
      (4)　小牛血清

      (5)　底物溶液

1.0ml EDTA (1.0×10－２M）

2.0ml Eosin(1.0×10－３M）

1.0ml H２O２(7.5×10－３M) 　　用三蒸水稀釋到25ml

0.4ml HCl (1.0×10－２M)

0.2ml Tween20 (1％)

      (6)　luminol 5.0×10－４M

      2.　器材

      (1)　LKB-1250 lumimeter

      (2) 隔水式電熱恒溫培養箱

      (3)　各種規格加樣器，小玻璃試管，聚苯乙烯珠

      (4)　洗瓶、抽濾裝置等
      (四)　注意事項

      1.　洗滌要徹底，以免因血清中其他來(lái)源的過(guò)氧化物酶類(lèi)物質(zhì)所產(chǎn)生的非特異性反
應，而影響測定結果。

      2.　實(shí)驗中，應分別設置陽(yáng)性、陰性、空白對照來(lái)控制實(shí)驗條件，且每份樣品均應做三個(gè)復管，以保證實(shí)驗結果的準確性。

      3.　為了克服酶標抗體因非特異性吸附而造成的較高本底，可用適量小牛血清加以抑制。

      4.　當加入luminol后，迅速產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光并使發(fā)光在一秒鐘內達到峰值，犎;后很快衰減到基線(xiàn)水平。因此，只有當小試管置于儀器的測量位置時(shí)，方可加入luminol。

      5.　底物的加入，是為了增強化學(xué)發(fā)光強度。但只有當底物分子與酶催化活性中心充分接觸時(shí)，反應速度才能加快。當反應進(jìn)行15min達到平衡時(shí)，牷/學(xué)發(fā)光強度則不再隨時(shí)間的延長(cháng)而變化，且在1h內保持穩定，因此，控制底物與酶反應15min后加luminol進(jìn)行化學(xué)發(fā)光測定。

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