免疫組化難題集錦【二】
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發(fā)布時(shí)間：2016-09-20
1、在什么情況下使用TritonX-100？
（1）Triton X-100化學(xué)名稱(chēng)為聚乙二醇辛基苯基醚，是一種去污劑。在免疫組織化學(xué)(>10um厚切片)和免疫細胞化學(xué)中一般用Triton X-100 作為細胞通透劑，在膜上打孔。
（2）其作用原理：Triton X-100 可以溶解細胞膜、細胞核膜、細胞器膜上的脂質(zhì)而使抗體及大分子結構的物質(zhì)進(jìn)入胞漿和胞核內，故在細胞免疫組化時(shí)尤為推薦使用，這樣抗體就能順利進(jìn)入胞內與相應抗原結合。
（3)Triton X-100既是一種表面活性劑，也有抗氧化作用，詳見(jiàn)下圖
2、封閉血清的選擇原則是什么？
（1）膜上或切片上有剩余的位點(diǎn)可以非特異性吸附抗體，造成后續結果的假陽(yáng)性！
（2）封閉血清一般是和二抗同一來(lái)源的，血清中動(dòng)物自身的抗體，預先能和組織中有交叉反應的位點(diǎn)發(fā)生結合，否則在后面的步驟中如果和二抗發(fā)生結合，會(huì )造成背景。
（3）也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能與一抗來(lái)源一致。
3、抗體孵育條件的比較？
（1）一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果最佳；孵育時(shí)間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37度1-2h，而4度過(guò)夜和從冰箱拿出后37度復溫45min。
（2）二抗一般室溫或37度30min-1h，具體時(shí)間需要摸索。
4、一抗4度孵育后為什么要進(jìn)行37度復溫？
（1）一方面，防止切片從4度直接放入PBS易脫片；
（2）另一方面，使抗原抗體結合更穩定。一般不需要,但對表達較弱的抗原可能有用,4度和37度時(shí)分子運動(dòng)方式不同,前者分子碰撞機率和運動(dòng)速度小于后者,后者結合更快,但敏感性也提高了并易造成非特異染色。
（3）其實(shí)我更贊同后一種說(shuō)法，因為我嘗試把肝臟或睪丸片子從4度過(guò)夜拿出后，直接用PBS洗沒(méi)發(fā)生過(guò)脫片現象。當然，事實(shí)勝于雄辯！
