注意事項：

1.  選擇適當得細胞接種濃度。

2.  避免血清干擾：一般選小于10％的胎牛血清的培養液進(jìn)行試驗。在呈色后盡量吸盡孔內殘余培養液。

3.  設空白對照：與試驗平行不加細胞只加培養液的空白對照。其他試驗步驟保持一致，最后比色以空白調零。

MTT實(shí)驗吸光度最后要在0-0.7之間，超出這個(gè)范圍就不是直線(xiàn)關(guān)系，IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的時(shí)候藥物的濃度。把藥品稀釋成不同的濃度，然后計算各自的抑制率，以藥品的濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標作圖，然后得到50％抑制率時(shí)候的藥品濃度，就是IC50。要點(diǎn)：藥品2倍稀釋?zhuān)嘧鎏荻?，做點(diǎn)線(xiàn)圖即可！

舉個(gè)例子：

IC50=0.00025

參考公式：

公式中的最大最小陽(yáng)性反應率就是最大最小抑制率

例：

1.  選擇適當得細胞接種濃度。

2.  避免血清干擾：一般選小于10％的胎牛血清的培養液進(jìn)行試驗。在呈色后盡量吸盡孔內殘余培養液。

3.  設空白對照：與試驗平行不加細胞只加培養液的空白對照。其他試驗步驟保持一致，最后比色以空白調零。

MTT實(shí)驗吸光度最后要在0-0.7之間，超出這個(gè)范圍就不是直線(xiàn)關(guān)系，IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的時(shí)候藥物的濃度。把藥品稀釋成不同的濃度，然后計算各自的抑制率，以藥品的濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標作圖，然后得到50％抑制率時(shí)候的藥品濃度，就是IC50。要點(diǎn)：藥品2倍稀釋?zhuān)嘧鎏荻?，做點(diǎn)線(xiàn)圖即可！

舉個(gè)例子：

IC50=0.00025

參考公式：

公式中的最大最小陽(yáng)性反應率就是最大最小抑制率

例：

用96孔板培養SMMC-7721肝癌做MTT測細胞活力，應該加多少1640培養基，多少MTT和DMSO合適根據書(shū)上說(shuō)的加200 ul 1640，20 u lMTT，150 ul DMSO加DMSO之前要盡量去掉培養液，便于DMSO溶解甲臜顆粒進(jìn)行比色測定，一般每孔4000個(gè)細胞為宜，既細胞濃度在20000個(gè)/ml，MTT加20 ul，作用四小時(shí)后洗掉上清液，注意不要將甲瓉洗掉，然后每孔加150 ul DMSO，在脫色搖床上振蕩10分鐘，然后測吸光值。

一、經(jīng)驗總結

1.  首先細胞的接種密度一定不能過(guò)大，一般每孔1000個(gè)左右就夠了，我認為寧少勿多。尤其是對于腫瘤細胞。10000/孔是太高了，這樣即使藥物有作用，MTT方法也是表現不出的，最佳點(diǎn)板濃度在4000-5000/孔，太少的話(huà)SD值會(huì )很大。

2.  MTT本身就是比較粗的實(shí)驗，增殖率10%左右的波動(dòng)都不算奇怪。特別是新手，20%的波動(dòng)也是常見(jiàn)的，所以很可能是技術(shù)原因引起的，特別是種板技術(shù)一定要過(guò)關(guān)。

3.  我做的是腫瘤細胞的MTT實(shí)驗，這種細胞長(cháng)的很快一開(kāi)始我是用100000/ML的濃度來(lái)接種的，結果細胞長(cháng)的太滿(mǎn)結果是沒(méi)有梯度也沒(méi)有線(xiàn)性關(guān)系.后來(lái)調整濃度，用過(guò)40000~80000/ML的濃度都做過(guò)MTT實(shí)驗，結果發(fā)現做的結果比較好點(diǎn)的是60000~70000/ML的濃度組的.用40000/M的濃度的組，由于細胞少，藥物作用的梯度還是有，只是沒(méi)有很好的線(xiàn)性關(guān)系.還有根據細胞生長(cháng)速度以及藥物的特性（有時(shí)間依賴(lài)性和濃度依賴(lài)性的藥物）來(lái)確定培養時(shí)間是48小時(shí)還是72小時(shí).

4.  注意細胞懸液一定要混勻，已避免細胞沉淀下來(lái)，導致每孔中的細胞數量不等，可以每接幾個(gè)就要再混勻一下。加樣器操作要熟練，盡量避免人為誤差。雖然移液器比移液管精確得多，但是如果操作不熟，CV會(huì )在8%左右。另外，吹散次數過(guò)多也會(huì )影響細胞活力。所以要熟練鞋、快些上板。

二、實(shí)驗心得分享

5.  向每孔中用槍頭加入細胞時(shí)不要太快，否則你會(huì )發(fā)現細胞在加入的瞬間會(huì )由于槍頭的沖力在孔底聚集一堆，一般都在孔的底部中央，而周邊很少，這種不均勻的分散會(huì )產(chǎn)生接觸抑制，影響細胞的生長(cháng)。所以速度不能太快也不能太慢。我習慣每塊板加完后平握手中，向左3下，向右3下，在往返回復3下移動(dòng)，目的是使得細胞能分散的均勻些。（鋪板技術(shù)是MTT實(shí)驗的關(guān)鍵，也是基礎，一定要練好。曾經(jīng)有同學(xué)用漩渦振蕩器混勻細胞，最后細胞全死了，建議不要采用這種方法混勻細胞。

（本文轉載丁香通）