免疫熒光實(shí)驗作為最常見(jiàn)的實(shí)驗之一，應用化學(xué)方法將熒光色素（主要是異硫氰酸熒光黃，fluorescein isoth iocyanate,FITC）與抗體結合起來(lái)，即熒光抗體，這種結合熒光色素的抗體的免疫原性并不因此而發(fā)生改變。

實(shí)驗原理：

在特定條件下用其著(zhù)染標本，如果標本中存在有相應的抗原，熒光抗體便與標本中的抗原發(fā)生特異性結合，在熒光顯微鏡的藍紫光或紫外光照射下，標本中的抗原抗體復合物便發(fā)出特異的熒光，熒光的出現表明被檢標本中特異抗原的存在；如果標本中不存在相應抗原，兩者便不能結合，水洗時(shí)，熒光抗體便被洗掉，因而標本在熒光顯微鏡下觀(guān)察不呈現特異熒光。因此，可以根據熒光的有無(wú)及強弱來(lái)判定抗原與抗體是否存在或相對應。

那么常用的免疫熒光雙標的實(shí)驗過(guò)程是怎么樣的呢，小編就帶著(zhù)大家簡(jiǎn)單的復習一下！

(1)直接法雙重免疫熒光標記：

將標記有兩種不同熒光素的抗體(如抗A和抗B)以適當比例混合，滴加在標本上孵育，然后洗去未結合的熒光抗體，在熒光顯微鏡下分別選擇兩種相應的激發(fā)濾片觀(guān)察，即可對兩種抗原進(jìn)行定位和定量。直接法簡(jiǎn)便可靠，但靈敏度較低。

(2)間接法雙重免疫熒光標記：

用未標記的兩種特異性第一抗體孵育組織或細胞，洗去多余的第一抗體后，再用兩種不同的熒光素分別標記的第二抗體孵育組織或細胞，洗去多余的第二抗體，后在熒光顯微鏡下分別選擇兩種相應的激發(fā)濾片觀(guān)察，從而對兩種抗原進(jìn)行定位和定量。使用此法應注意兩種特異性第一抗體必須來(lái)源于不同種屬，且熒光標記第二抗體的種屬必須與第一抗體的種屬相匹配。

實(shí)驗注意事項： 

1、熒光染色后一般在1h內完成觀(guān)察，或于4℃保存4h，時(shí)間過(guò)長(cháng)，可能會(huì )使熒光提前衰退。

2、每次試驗均需設置以下三種對照：

(1) 陽(yáng)性對照：陽(yáng)性血清+熒光標記物;

(2) 陰性對照：陰性血清+熒光標記物;

(3) 熒光標記物對照：PBS+熒光標記物。

1、合適的細胞密度

細胞密度是試驗成功的第一步，細胞密度太大，會(huì )造成細胞過(guò)于擁擠而邊界不清晰，不僅細胞形態(tài)不佳且易導致染色背景深。同理細胞過(guò)少時(shí)不僅容易貼壁不好觀(guān)察時(shí)不好找細胞，而且由于細胞過(guò)少可能活性不佳從而易發(fā)生非特異性熒光染色。不管是用六孔板還是共聚焦皿細胞密度以達到75%-85%最佳。

2、細胞固定和通透

固定劑的選擇依賴(lài)于抗原的亞細胞定位（膜蛋白，可溶，細胞骨架相關(guān)蛋白等）。3.7%-4%的甲醛或多聚甲醛是最常用的固定劑，適用于絕大多數蛋白。如果是研究膜蛋白的話(huà)，最好用3.7%-4%的甲醛。而研究細胞骨架成分可用甲醇固定法。固定后一般需要通透步驟，通透即是在膜上打孔，讓抗體更易進(jìn)入細胞與抗原結合。

選擇通透劑應充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。通透一般可以用0.1%-0.2%的Triton-X 100，而選擇甲醇固定一般無(wú)需再通透，甲醇本身就有通透的作用。

3、封閉條件的優(yōu)化選擇

為了防止內源性非特異性蛋白抗原的結合，需要在一抗孵育前用封閉液封閉，這樣可以減少非特異性的背景著(zhù)色。封閉液可以選擇二抗來(lái)源一致的血清，一般來(lái)說(shuō)，血清價(jià)格比較昂貴，可以用1%-5%BSA替代，BSA可以說(shuō)是萬(wàn)能的封閉血清。另外封閉時(shí)間不易過(guò)長(cháng)，30-60min即可，且封閉后不用洗滌，直接加一抗孵育即可。

4、一抗二抗的選擇

封閉過(guò)后需要一抗孵育，可以選擇4度過(guò)夜孵育或者室溫3h，以筆者的經(jīng)驗是一抗孵育4度過(guò)夜比較好，抗原抗體結合會(huì )比較充分。一抗二抗的稀釋比例可以根據抗體說(shuō)明書(shū)來(lái)，再根據自己具體的實(shí)驗要求進(jìn)行優(yōu)化。如果抗體濃度過(guò)低，會(huì )造成信號太弱，如果抗體濃度過(guò)高可能會(huì )造成背景染色太強。熒光二抗個(gè)人感覺(jué)Alex flour熒光基團信號強于Dylight強于FITC。如果做免疫雙標，一抗要來(lái)自不同種屬，熒光二抗的光譜也要分開(kāi)。

5、洗滌步驟

免疫熒光過(guò)程中，有很多洗滌步驟，用PBS即可。在洗滌過(guò)程中，一要注意動(dòng)作輕柔，固定后的細胞比較脆弱，如果太過(guò)大力，很容易把細胞吹洗掉，二是洗滌時(shí)間要把握好，每次洗滌5min左右，三是切忌不要干片，即吸掉溶液后不要把細胞干著(zhù)，不然容易造成背景著(zhù)色。