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姐妹染色單體分化染色

1. 實(shí)驗原理

        姐妹染色單體分化染色法(Sister chromatid differentiation,SCD)是20世紀70年代中期發(fā)展起來(lái)的染色體處理技術(shù)。1973年Latt在培養的細胞中加入5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-Bromode Oxyurdine,BrdU),用Hoechst 33258 熒光染料染色時(shí),發(fā)現了姐妹染色單體的色差反應和它們之間互換的現象。1974年KO Renberg和Froeed-Lender改進(jìn)了這一技術(shù),用Giemsa染色。SCD形成原理(圖13-2)是:在細胞培養過(guò)程中,加入5-溴脫氧尿苷,當細胞的DNA復制時(shí),Brdu可作為核苷酸前體物專(zhuān)一取代胸腺嘧啶而被摻入到新合成DNA鏈中。第二周期加入BrdU,每條新合成的染色單體DNA雙鏈中舊模板沒(méi)有摻入,半保留復制的新鏈被BUdR摻入;當細胞處于第三個(gè)分裂周期時(shí),同一染色體的兩條姐妹染色單體,一條由雙股都含有BrdU的DNA鏈構成,而另一條為單股含有BrdU的DNA鏈。在結構上雙股含BrdU的DNA螺旋化程度降低,故對染色劑親和力低,在用Giemsa染色時(shí)著(zhù)色淺,只有單股含BrdU的DNA鏈組成的單體則著(zhù)色深而形成差別著(zhù)色。應用姐妹染色單體區分染色法研究來(lái)自一個(gè)染色體的兩條單體之間在同一個(gè)位點(diǎn)發(fā)生同源片段的交換,稱(chēng)為姐妹染色單體互換(sister chromotid exchange,SCE)。SCE是兩條染色單體核苷酸序列發(fā)生互換而表現出來(lái)的一種現象。

         這種技術(shù)用于研究細胞周期、染色體半保留復制、染色體的分子結構和畸變,以及DNA的復制、損傷與修復等一系列重要理論問(wèn)題。由于SCE能靈敏地檢測染色體的變化,表現出劑量-效應關(guān)系,還可以將姐妹染色單體互換頻率列為檢測致突變物、致癌物的常規指標之一。
2. 實(shí)驗對象 所檢培養細胞。
3. 實(shí)驗試劑與器材
       (1)BrdU貯存液的配制:BrdU 5mg(先用0.5ml 1N NaOH溶解)然后加蒸餾水至 5ml即成1000μg/ml的貯存液,因BrdU遇光會(huì )發(fā)生分解,貯存液需置棕色瓶并黑紙封瓶避光冰凍保存;
       (2)2×SSC液,水浴鍋,20W紫外燈一個(gè),培養皿,鏡頭紙。
4. 實(shí)驗方法與步驟
       (1)Brdu摻入:細胞培養24h后于培養液中加入Brdu,最終濃度10μg/ml,避光條件下繼續培養。
       (2)待細胞經(jīng)歷兩個(gè)細胞周期(48h),培養終止前4h加秋水仙素,秋水仙素終濃度為0.02μg/ml培養液;
       (3)常規制片,染色體制片在 37℃ 恒溫箱內老化24h;
       (4)紫外燈照射:取標本玻片置于大號培養皿內,正面朝上,上覆蓋鏡頭紙,從玻片外鏡頭紙邊沿加2×SSC液致使全鏡頭紙浸濕,移入 60℃ 水浴鍋內,紫外線(xiàn)燈距離 5cm ,照射30min;
       (5)染色:取出照射后標本,蒸餾水沖洗,置pH6.8的2%Giemsa染色10min。
5. 注意事項
       (1)BrdU是一種強突變劑,使用濃度不宜過(guò)高,否則會(huì )產(chǎn)生細胞毒性作用。

       (2)影響SCE的因素:地區與環(huán)境,Brdu的濃度,動(dòng)物的種類(lèi),染色體長(cháng)度,培養時(shí)間與溫度。


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