1. 外泌體提取及方法學(xué)評價(jià)
到目前為止，仍沒(méi)有一種提取方法能同時(shí)保證外泌體的含量、純度以及生物活性。
1.1 離心法
這是目前外泌體提取最常用的方法。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，收集細胞培養液以后依次在300 g、2 000 g、10 000 g離心去除細胞碎片和大分子蛋白質(zhì)，最后100 000 g離心得到外泌體。此種方法得到的外泌體量多，但是純度不足，電鏡鑒定時(shí)發(fā)現外泌體聚集成塊，由于微泡和外泌體沒(méi)有非常統一的鑒定標準，也有一些研究認為此種方法得到的是微泡不是外泌體。
1.2 過(guò)濾離心
過(guò)濾離心是利用不同截留相對分子質(zhì)量(MWCO)的超濾膜離心分離外泌體。截留相對分子質(zhì)量是指能自由通過(guò)某種有孔材料的分子中最大分子的相對分子質(zhì)量。外泌體是一個(gè)囊狀小體，相對分子質(zhì)量大于一般蛋白質(zhì)，因此選擇不同大小的MWCO膜可使外泌體與其他大分子物質(zhì)分離。這種操作簡(jiǎn)單、省時(shí)，不影響外泌體的生物活性，但同樣存在純度不足的問(wèn)題。
1.3 密度梯度離心法
密度梯度離心是將樣本和梯度材料一起超速離心，樣品中的不同組分沉降到各自的等密度區，分為連續和不連續梯度離心法。用于密度梯度離心法的介質(zhì)要求對細胞無(wú)毒，在高濃度時(shí)粘度不高且易將pH調至中性。實(shí)驗中常用蔗糖密度梯度離心法，在離心法的基礎上，預先將兩種濃度蔗糖溶液(如2.5 M 和0.25 M)配成連續梯度體系置于超速離心管中，樣本鋪在蔗糖溶液上，100 000 g離心16 h，外泌體會(huì )沉降到等密度區(1.10~1.18 g/ml)。用此種方法分離到的外泌體純度高，但是前期準備工作繁雜，耗時(shí)，量少。
1.4 免疫磁珠法
泌體相關(guān)抗原的抗體(如CD9、CD63、Alix)與外泌體共同孵育，蒸餾水沖洗后，重懸于PBS緩沖液中。這種方法可以保證外泌體形態(tài)的完整，特異性高、操作簡(jiǎn)單、不需要昂貴的儀器設備, 但是非中性pH和非生理性鹽濃度會(huì )影響外泌體生物活性，不便進(jìn)行下一步的實(shí)驗。
1.5 色譜法
色譜法是利用根據凝膠孔隙的孔徑大小與樣品分子尺寸的相對關(guān)系而對溶質(zhì)進(jìn)行分離的分析的方法。樣品中大分子不能進(jìn)入凝膠孔，只能沿多孔凝膠粒子之間的空隙通過(guò)色譜柱，首先被流動(dòng)相洗脫出來(lái)；小分子可進(jìn)入凝膠中絕大部分孔洞，在柱中受到更強地滯留，更慢地被洗脫出。分離到的外泌體在電鏡下大小均一，但是需要特殊的設備，應用不廣泛。（轉帖）
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