1.細菌電轉化感受態(tài)細胞的制備

1）由-70度冰箱中保存得菌種劃單菌落，過(guò)夜培養16－20hr。晚上將將新鮮的菌落接種于2ml-5mlSOB培養基的試管中，37℃振蕩培養過(guò)夜，轉速控制在180rpm。

2）第二天，取過(guò)夜培養物250uL轉接入含50ml SOB培養基（1：200）的500mL搖瓶中，37℃劇烈振蕩 （300rpm）培養至OD600約為0.72-0.76，將細菌培養物置于冰水混合物中驟冷。

3）用兩個(gè)預冷的50ml離心管于4℃ 2000g離心10分鐘。收集菌體，棄上清。

4）用預冷的水（純凈雙蒸水，高壓蒸汽滅菌）輕輕重懸菌體，先加入少量水重懸菌體，然后把水加滿(mǎn)，4℃ 2200g離心10分鐘，棄上清。

5）再用10%甘油重復步驟4）兩次，2400g離心10分鐘，最后一次倒盡上清后，用殘存管底的甘油懸浮細胞，分裝ep管，100ul/支（一般，25ml起始培養物最終用200-250uL10%甘油懸?。?。

6）放入液N2中速凍，保存于－70℃。

注意

1） 菌種最好是－70℃凍存的，活化后生長(cháng)狀態(tài)較好。

2） 2ml培養過(guò)夜，震蕩速度不要過(guò)高（一般應該是37度，300rpm，6hr，當天轉接，這樣一天內工作量太大，這里我們選擇過(guò)夜培養，時(shí)間長(cháng)，轉速控制在180rpm, 可以適當縮短時(shí)間，前一天晚接種，第二天早轉接）

3） 培養完畢后一定要驟冷，使培養物在短時(shí)間內迅速冷卻。冰水混合物中搖動(dòng)瓶子，大約10分鐘。

4）所使用得器皿一定要非常干凈，沒(méi)有化學(xué)物質(zhì)殘存，可以先用餐洗凈洗，再加入NaOH固體和蒸餾水產(chǎn)熱，最后用蒸餾水反復沖洗干凈。注意pH值檢測。

5）培養完畢后得離心操作一定要低溫，所用的水和甘油，離心管都要冰上預冷。

6）整個(gè)過(guò)程盡量不要用槍吹打。

7）器皿和試劑最好最后用重蒸水涮洗和配制。

8）控制好菌體的OD600值，我用JM109操作時(shí)值為0.727和0.757時(shí)都獲得非常高效的轉化率。而0.83時(shí)轉化率明顯降低。根據季節不同JM109達到相應OD值

所需時(shí)間有所差異2.5hr-3hr45min。

9）最后一次務(wù)必倒盡上清后，用殘存管底的甘油懸浮細胞，一般每管僅剩200uL左右。切務(wù)用過(guò)多甘油液懸浮細胞，我曾用350-500uL10％甘油/25mL出發(fā)菌液，導致細胞濃度下降，電轉效率低2-3個(gè)數量級。

2.電轉化protocol1

1） 將電擊杯冰上預冷 ，凍存的感受態(tài)細胞取出冰上融解

2） 30ul感受態(tài)細胞，加入1ul純化的連接液（或者加入0.3-0.5uL未純化的連接液），冰上放置60s－90s

3） 將混合液加入預冷的電擊杯， 注意擦干杯外的水，防止電火花

4） 3kv，200歐姆，25uF（我們用的是BioRad 電轉化儀，0.2電轉化杯），時(shí)間常數應該在4.5－5ms之間（其值越大，說(shuō)明感受態(tài)細胞中離子去除越徹底。） 電擊

5） 加入1ml 37度保溫的SOC，將混和液洗出，此步有熱擊的作用，室溫進(jìn)行

6） 37度震蕩培養1－1.5hr，可適當延長(cháng)時(shí)間，使其充分表達抗性

7） 涂板

注意

1） 電擊之前保持低溫狀態(tài)。

2） 連接液要純化，去除離子，ddH2O溶；或者加入0.3-0.5uL未純化的連接液，切務(wù)過(guò)多以免電火花，我曾試過(guò)0.3uL和0.6uL連接液的加入細胞做對比，轉化效率相當。

3） 原核生物受體細胞電擊以15kv/cm 場(chǎng)強為最佳，電擊電壓根據電擊杯厚度選擇

4） 電擊杯使用完，用針頭蒸餾水反復沖洗杯底，再用70％乙醇浸泡，4度存放，使用前烘干即可?；蛘吆娓珊?，-20度冰箱存放。

5）37度震蕩培養時(shí)間切務(wù)過(guò)長(cháng)，否則會(huì )有很多的衛星菌落和輕微的菌膜干擾。我曾培養1hr45min即出現上述衛星菌落和輕微的菌膜干擾。

試劑配制（重蒸水配制）：

SOB：2.0％胰蛋白胨、0.5％酵母浸粉、0.05％NaCl完全溶解攪勻，加入2.5mMKCl 并用NaOH調PH7.0，滅菌后加入過(guò)濾除菌的MgCl2備用；

實(shí)際配制100mL時(shí)：2g bacto－trptone、0.5g bacto－yeast extract、0.05g NaCl完全溶加0.0186g KCl，10N NaOH一小滴即可調至PH7.0 分裝入50mL培養基/500mL瓶高壓滅菌；此后50mL中加入250uL 2M MgCl2即為SOB培養基；

SOC：50mL無(wú)菌SOB培養基+1mL 1M 過(guò)濾除菌的葡萄糖即為SOC，分裝1mL每管，凍存于-20備用。

10％甘油：用分子生物學(xué)級別的甘油。