摘要：外泌體最早發(fā)現于體外培養的綿羊紅細胞上清液中，是細胞主動(dòng)分泌的大小較為均一，直徑為40~100納米，密度1.10~1.18 g/ml的囊泡樣小體。

細胞外泌體攜帶多種蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA，參與細胞通訊、細胞遷移、血管新生和腫瘤細胞生長(cháng)等過(guò)程并且有可能成為藥物的天然載體，應用于臨床治療。然而，測量技術(shù)手段的局限限制了外泌體在這些領(lǐng)域的研究進(jìn)展。這篇文章總結了外泌體的純化方法，比較了現存各種外泌體測量技術(shù)，并重點(diǎn)介紹了一種新的測量技術(shù)，即納米微粒追蹤分析術(shù)，在外泌體尺寸和表征研究中的應用。

1. 外泌體提取及方法學(xué)評價(jià)

到目前為止，仍沒(méi)有一種提取方法能同時(shí)保證外泌體的含量、純度以及生物活性。

1.1 離心法

這是目前外泌體提取最常用的方法。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，收集細胞培養液以后依次在300 g、2 000 g、10 000 g離心去除細胞碎片和大分子蛋白質(zhì)，最后100 000 g離心得到外泌體。此種方法得到的外泌體量多，但是純度不足，電鏡鑒定時(shí)發(fā)現外泌體聚集成塊，由于微泡和外泌體沒(méi)有非常統一的鑒定標準，也有一些研究認為此種方法得到的是微泡不是外泌體。

1.2 過(guò)濾離心

過(guò)濾離心是利用不同截留相對分子質(zhì)量(MWCO)的超濾膜離心分離外泌體。截留相對分子質(zhì)量是指能自由通過(guò)某種有孔材料的分子中最大分子的相對分子質(zhì)量。外泌體是一個(gè)囊狀小體，相對分子質(zhì)量大于一般蛋白質(zhì)，因此選擇不同大小的MWCO膜可使外泌體與其他大分子物質(zhì)分離。這種操作簡(jiǎn)單、省時(shí)，不影響外泌體的生物活性，但同樣存在純度不足的問(wèn)題。

1.3 密度梯度離心法

 密度梯度離心是將樣本和梯度材料一起超速離心，樣品中的不同組分沉降到各自的等密度區，分為連續和不連續梯度離心法。用于密度梯度離心法的介質(zhì)要求對細胞無(wú)毒，在高濃度時(shí)粘度不高且易將pH調至中性。實(shí)驗中常用蔗糖密度梯度離心法，在離心法的基礎上，預先將兩種濃度蔗糖溶液(如2.5 M 和0.25 M)配成連續梯度體系置于超速離心管中，樣本鋪在蔗糖溶液上，100 000 g離心16 h，外泌體會(huì )沉降到等密度區(1.10~1.18 g/ml)。用此種方法分離到的外泌體純度高，但是前期準備工作繁雜，耗時(shí)，量少。

1.4 免疫磁珠法

泌體相關(guān)抗原的抗體(如CD9、CD63、Alix)與外泌體共同孵育，蒸餾水沖洗后，重懸于PBS緩沖液中。這種方法可以保證外泌體形態(tài)的完整，特異性高、操作簡(jiǎn)單、不需要昂貴的儀器設備, 但是非中性pH和非生理性鹽濃度會(huì )影響外泌體生物活性，不便進(jìn)行下一步的實(shí)驗。

1.5 色譜法

色譜法是利用根據凝膠孔隙的孔徑大小與樣品分子尺寸的相對關(guān)系而對溶質(zhì)進(jìn)行分離的分析的方法。樣品中大分子不能進(jìn)入凝膠孔，只能沿多孔凝膠粒子之間的空隙通過(guò)色譜柱，首先被流動(dòng)相洗脫出來(lái)；小分子可進(jìn)入凝膠中絕大部分孔洞，在柱中受到更強地滯留，更慢地被洗脫出。分離到的外泌體在電鏡下大小均一，但是需要特殊的設備，應用不廣泛。

2. 外泌體測量各種方法的比較

2.1 電子顯微鏡

掃描電子顯微鏡(SEM)的工作原理是以能量為1-30KV間的電子束，以光柵狀掃描方式照射到被分析試樣的表面上，利用入射電子和試樣表面物質(zhì)相互作用所產(chǎn)生的二次電子和背散射電子成象，獲得試樣表面微觀(guān)組織結構和形貌信息，并且具有較高的分辨率。由于超高真空技術(shù)的發(fā)展，場(chǎng)發(fā)射電子槍的應用得到普及，現代先進(jìn)的掃描電鏡的分辨率已經(jīng)達到1納米左右，足夠用來(lái)進(jìn)行外泌體尺寸的測量。鑒于SEM的工作特點(diǎn)，在外泌體研究中，能夠直接觀(guān)察到樣品中外泌體的形態(tài)。并且SEM具有很高的分辨率，能夠鑒別不同大小的外泌體。但SEM對樣品的預處理和制備上面要求較高，樣品的準備階段比較復雜，不適合對外泌體進(jìn)行大量快速的測量。而且由于外泌體經(jīng)過(guò)了預處理和制備過(guò)程，無(wú)法準確的進(jìn)行外泌體濃度的測量。

2.2 動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)

動(dòng)態(tài)光散射是收集溶液中做布朗運動(dòng)的顆粒散射光強度起伏的變化，通過(guò)相關(guān)儀？器將光強的波動(dòng)轉化為相關(guān)曲線(xiàn)，從而得到光強波動(dòng)的速度，計算出粒子的擴散速度信息和粒子的粒徑。小顆粒樣品的布朗運動(dòng)速度快，光強波動(dòng)較快，相關(guān)曲線(xiàn)衰減較快，大顆粒反之(圖1)。

                                     圖1 大顆粒和小顆粒光強波動(dòng)及相關(guān)曲線(xiàn)

  在外泌體研究中，動(dòng)態(tài)光散射測量敏感度較高，測量下限為10納米。相對于SEM技術(shù)來(lái)說(shuō)，樣品制備簡(jiǎn)單，只需要簡(jiǎn)單的過(guò)濾，測量速度較快。但由于動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)是測量光強的波動(dòng)數據，所以大顆粒的光強波動(dòng)信號會(huì )掩蓋較小顆粒的光強波動(dòng)信號，所以動(dòng)態(tài)光散射不適合大小不一的復雜外泌體樣本的測量，只適合通過(guò)色譜法制備的大小均一的外泌體的尺寸測量，并且無(wú)法測量樣品中外泌體的濃度。

2.3 納米微粒追蹤分析術(shù)

納米微粒追蹤分析術(shù)(以下簡(jiǎn)稱(chēng)NTA)是一種比較新穎的研究納米顆粒的方法，可以直接和實(shí)時(shí)的觀(guān)測納米顆粒。NTA通過(guò)光學(xué)顯微鏡收集納米顆粒的散射光信號，拍攝一段納米顆粒在溶液中做布朗運動(dòng)的影像，對每個(gè)顆粒的布朗運動(dòng)進(jìn)行追蹤和分析，從而計算出納米顆粒的流體力學(xué)半徑和濃度。

NTA系統的工作原理是將一束能量集中的激光穿過(guò)玻璃棱鏡對樣品(懸浮顆粒的溶液)進(jìn)行照射(光路圖見(jiàn)圖2)

                                            圖2 NTA激光光路圖

激光光束從較小角度入射進(jìn)入樣品溶液，照亮溶液中的顆粒。配備相機的光學(xué)顯微鏡，被放置在特定的位置上，收集視野中被照亮的納米顆粒發(fā)射出的光散射信號。 樣品池有大約500微米的深度，采樣點(diǎn)激光照亮寬度為20微米，這個(gè)數值和光學(xué)顯微鏡的聚焦的視野深度相匹配。相機會(huì )進(jìn)行60秒的影像拍攝，每秒30個(gè)采樣畫(huà)面。顆粒的運動(dòng)過(guò)程被NTA軟件進(jìn)行分析。NTA軟件在每幅被記錄的畫(huà)面中鑒別和追蹤做布朗運動(dòng)的納米顆粒。

根據顆粒的運動(dòng)速度，通過(guò)二維 Stokes-Einstein方程計算顆粒流體力學(xué)半徑

在方程中<x,y>2是均方位移，KB是Boltzmann常數; T是溶液的溫度，單位是Kelvin;  ts是采樣時(shí)間，例如，1/30 fpsec = 33 msec； η是溶液粘度；dh是流體力學(xué)直徑。 NTA檢測顆粒大小的范圍和顆粒本身的折光指數相關(guān)。測量的下限取決于被研究顆粒和背景之間信噪比，也就是顆粒的散射光強度和背景的光強差距。顆粒的散射光強度根據Rayleigh散射方程，受到以下因素的影響

 其中，d是顆粒的直徑，λ是入射光的波長(cháng)，n是顆粒和溶液的折光系數比。通常來(lái)說(shuō)，生物樣品，如外泌體等，折光系數較低，所以測量下限為30-40納米。

由于直接追蹤樣品中每一個(gè)納米顆粒，因此NTA技術(shù)對復雜的樣品具有極高的分辨率。為了證明NTA對于復雜樣品的分辨能力，我們將100納米和300納米兩種不同大小的聚苯乙烯顆粒按照5:1的數量混合，使用NTA進(jìn)行測量(圖3A)。盡管其分布圖形有一定的重疊，但兩種不同大小的納米顆粒的峰清楚的區分開(kāi)來(lái)。這種對復雜樣品的分辨能力對于外泌體這樣的研究對象來(lái)說(shuō)是非常重要的。

NTA也能對樣品濃度進(jìn)行直接測量。對一系列濃度為1×108 - 8×108的100納米單分散樣品進(jìn)行測量，可以看到NTA測量濃度結果和實(shí)際濃度存在著(zhù)很好的線(xiàn)性相關(guān)(圖3B)。對于多分散體系，測量結果的準確取決于儀器參數的設定(照相機快門(mén)速度和光圈)，恰當的參數設定可以保證不同大小顆粒都能被NTA軟件追蹤和計算。

圖3  A. 100納米和300納米混合樣品NTA測量  B. NTA測量濃度和樣品實(shí)際濃度線(xiàn)性相關(guān)

NTA還具有分析熒光樣品的能力。NTA有四種不同波長(cháng)的激光器可以選擇，包括405納米, 488納米, 532納米和635納米的激光器，再搭配相應的濾光片，即可實(shí)現對熒光樣品的測量。將100納米的熒光標記的顆粒和200納米的非熒光顆粒用同一溶劑做成混合樣品，使用NTA進(jìn)行測量(圖4)。圖4中，藍色的線(xiàn)顯示為NTA的光散射模式，可以看到盡管100納米和200nm納米顆粒的分布圖有重疊，但還是清楚的區分了100納米和200納米的峰值。然后使用熒光濾光片進(jìn)行分析，只觀(guān)測到100納米的熒光標記的納米顆粒(紅線(xiàn))

                                                   圖4 NTA熒光樣品測量

由于外泌體表面有標志物CD9、CD63等跨膜分子的存在，在復雜的背景環(huán)境下(如血清中)，可以用熒光抗體標記外泌體，再用NTA的熒光測量功能實(shí)現在復雜背景下對外泌體的測量。相比較于流式細胞儀的熒光功能，NTA分辨率較高，且測量熒光顆粒的下限可以達到30-40納米，而流式細胞儀的測量下限為400納米。即使對于最新一代的數碼流式細胞儀，其測量下限已經(jīng)達到100納米，但由于它仍然建立在監測光信號的基礎上，所以測量和準確性和分辨率仍然不可靠。所以在外泌體熒光功能測量上，NTA具有獨特的優(yōu)勢。

3. 總結