篩選多肽的操作步驟
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發(fā)布時(shí)間：2016-09-17
第一天
以0.1M NaHCO3（pH 8.6）制備100mg/ml的靶分子溶液。如果需要穩定靶分子，可以用含有金屬離子的相似離子強度緩沖液。
在每孔內加入1.5ml靶分子溶液，重復渦旋直至表面完全濕潤（這一步要多注意，盡量避免溶液形成液珠）。
在濕盒中，4℃溫和振蕩孵育過(guò)夜。4℃保存于濕盒中備用。
第二天
將ER2537（滴度測定時(shí)用來(lái)鋪板的細菌培養物）接種至10ml LB培養基中。如果是在同一天擴增洗脫的噬菌體，也可以將ER2537過(guò)夜培養物接種于含有20ml LB培養基的250ml錐形瓶中（比例為1：100）。37℃劇烈振搖。
將平皿反扣在潔凈的紙巾上，去除包被液，加滿(mǎn)封閉液，4℃孵育至少1h。
去除包被液。用TBST（TBS+0.1%Tween-20）快速洗滌6次。反復旋轉確?？椎准翱讉让娑急幌礈?。按照步驟5的方法去除洗滌液（也可利用自動(dòng)洗板機洗滌）。洗滌要迅速，避免平皿干燥。（注意每次更換紙巾，以免交叉污染）。
用1ml TBST稀釋4′1010噬菌體（10ml原庫），加至包被后的平皿內，室溫下輕緩搖動(dòng)10~60min。
以步驟5的方法去除未結合的噬菌體。
以步驟6的方法用TBST洗滌板子10次，每次換用潔凈的紙巾，避免交叉污染。
用1ml的洗脫緩沖液洗脫結合的噬菌體。洗脫液可以是含有配體（0.1-1mM）的TBS，或是含有靶蛋白（~100mg/ml）的TBS以和固化在平皿上的靶蛋白競爭結合噬菌體。室溫下輕緩搖動(dòng)10~60min。將洗脫液轉入微量離心管中。
10a.或使用通用緩沖液，0.2M的甘氨酸-鹽酸（pH 2.2），1mg/ml BSA。輕緩搖動(dòng)不超過(guò)10min，將洗脫物轉入微量離心管中，以150ml 1M Tris-HCl（pH 9.1）中和。
取小量洗脫液（~1ml）測定滴度，如果有必要，可將第一輪或第二輪測定滴度的噬斑進(jìn)行測序（見(jiàn)后續操作）。（未用的洗脫物可4℃保存過(guò)夜，第二天進(jìn)行擴增。在這種情況下，用LB過(guò)夜培養ER2537，第二天，用LB培養基以1：100將該培養物稀釋至20ml，加入未擴增的洗脫液，在250ml的錐形瓶?jì)龋?7℃劇烈振搖孵育4.5h，進(jìn)入步驟13）。
將剩余的洗脫物進(jìn)行擴增：將洗脫物加入20ml ER2537培養物中（對數早期），37℃劇烈振搖孵育4.5h。
將培養物轉入微量離心管中，4℃，10，000轉離心10min，將上清轉入新的離心管中，再次離心。
將80%的上清轉入新的離心管中，加入1/6體積的PEG/NaCl。4℃沉淀噬菌體至少60min或過(guò)夜。
第三天
4℃，10，000轉離心PEG的沉淀物15min，傾去上清，再次離心，吸去多余的上清。
用1ml TBS懸浮沉淀物并轉入微量離心管中，4℃離心5min使殘留的細胞沉淀。
將上清轉入新的離心管中，用1/6體積的PEG/NaCl再次進(jìn)行沉淀，冰上孵育15~60min。4℃離心10min，棄上清，再次短暫離心，用微量槍頭吸去殘留的上清。
用200ml TBS，0.02%NaN3懸浮沉淀物，離心1min，將上清轉入新管中，即為擴增的洗脫液。
測定洗脫物在擴增后的濃度，貯存于4℃。
包被平皿進(jìn)行第二輪篩選，同步驟1~3。
第四和第五天
計數藍色噬斑，確定噬菌體的滴度，計算對應于1-2′1011 pfu的噬菌體體積。如果滴度太低，在篩選時(shí)可采用對應于109 pfu的噬菌體體積。
進(jìn)行第二輪篩選：重復步驟4~18，用含1-2′1011 pfu噬菌體的第一輪擴增洗脫液進(jìn)行篩選，將洗滌液中的Tween 20濃度增至0.5%。
測定第二輪篩選擴增洗脫液的滴度。
包被平皿進(jìn)行第三輪篩選，步驟1~3。
第六天
進(jìn)行第三輪篩選：用第二輪擴增洗脫液中1-2′1011 pfu噬菌體進(jìn)行篩選，洗滌時(shí)，Tween20的濃度仍為0.5%。
測定未擴增的第三輪洗脫液的滴度。如果不進(jìn)行第四輪篩選 則不必擴增第三輪的篩選洗脫物。滴度測定時(shí)的藍色噬斑可用于測序：平板的孵育時(shí)間不得長(cháng)于18h，因為時(shí)間過(guò)長(cháng)可能造成噬菌體感染率下降。將剩余的洗脫物保存于4℃。
選取單克隆ER2537過(guò)夜培養。
