柱層析技術(shù)簡(jiǎn)介
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發(fā)布時(shí)間：2016-09-20
一、簡(jiǎn)介
根據填充基質(zhì)和樣品分配交換原理不同，離子交換層析，凝膠過(guò)濾層析和親和層析是三種分離蛋白質(zhì)的經(jīng)典層析技術(shù)。
二、技巧和方法
1. 柱層析操作方法的選擇
目前，柱色譜分離的操作方式，主要包括常壓分離、減壓分離和加壓分離3種模式。常壓分離是最簡(jiǎn)單的分離模式方便、簡(jiǎn)單，但是洗脫時(shí)間長(cháng)。
減壓分離盡管能節省填料的使用量，但是由于大量的空氣通過(guò)填料會(huì )使溶劑揮發(fā)，并且有時(shí)在柱子外面會(huì )有水汽凝結，以及有些易分解的化合物也難以得到，而且還必須同時(shí)使用水泵或真空泵抽氣。
加壓分離可以加快淋洗劑的流動(dòng)速度，縮短樣品的洗脫時(shí)間，是一種比較好的方法，與常壓柱類(lèi)似，只不過(guò)外加壓力使淋洗液更快洗脫。壓力的提供可以是壓縮空氣，雙連球或者小氣泵等。
2. 柱子規格的選擇
市場(chǎng)上有各種規格的柱層析分離柱。柱子長(cháng)了，相應的塔板數就高，分離就好。目前市場(chǎng)上的柱子，其徑高比一般在1：5~10范圍，在實(shí)際使用時(shí)，填料量一般是樣品量的30~40倍，具體的選擇要根據樣品的性質(zhì)和含量進(jìn)行具體分析。
如果所需組分和雜質(zhì)的分離度較大，就可以減少填料量，使用內徑相對較小的柱子（如2 cm×20 cm 的柱子）；如果Rf相差不到0.1，就要加大柱子，增加填料量，比如用3 cm 內徑的柱子。
3. 裝柱
柱層析色譜柱的填裝主要有濕法和干法兩種，濕法省事，一般用淋洗劑溶解樣品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等，但溶劑越少越好，不然溶劑就成了淋洗劑了。柱子底端的活塞一定不要涂潤滑劑，否則會(huì )被淋洗劑帶到淋洗液中，可以采用聚四氟乙烯材料的閥門(mén)。
干法和濕法裝柱沒(méi)什么實(shí)質(zhì)性差別，只要能把柱子裝實(shí)就行。裝完的柱子應該有適度的緊密（太密了淋洗劑流速太慢），并且一定要均勻，不然樣品就會(huì )從一側斜著(zhù)流動(dòng)。
同時(shí)柱中不能有大氣泡，大多數情況下有些小氣泡沒(méi)太大的影響，因為只要加壓氣泡就可消失。但是柱子更忌諱的是開(kāi)裂，開(kāi)裂會(huì )影響分離效果，甚至報廢。
4. 溶劑的選擇
選擇一個(gè)合適的溶劑系統是柱層析分離的關(guān)鍵。在選用柱層析洗脫劑時(shí)首先要考慮三個(gè)方面的因素:溶解性（Solubil2ity）、親合性（Affinity）和分離度（Resolution）。
溶劑應選擇價(jià)廉、安全、環(huán)保的，可以考慮石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚、甲醇和正己烷等等。但正己烷價(jià)格較高，乙醚很易揮發(fā)，二氯甲烷和甲醇與硅膠的吸附是一個(gè)放熱過(guò)程，易使柱子產(chǎn)生氣泡。其他的溶劑用的相對較少，要依不同需要選擇。
另外值得一提的是，由于我們進(jìn)行的是痕量分析，淋洗劑的純度必須關(guān)注，一般使用農藥殘留級或HPLC級的，如果是分析純的必須進(jìn)行精制。同時(shí)溶劑在過(guò)柱后最好回收使用，一方面環(huán)保，另一方面也能節省部分經(jīng)費。
5. 上樣
用少量的溶劑溶解樣品加樣，加完后將底端的活塞打開(kāi)，待溶劑層下降至石英砂面時(shí)，再加少量的低極性溶劑，然后再打開(kāi)活塞，如此兩三次，一般石英砂就基本是白色的了。
加入淋洗劑，一開(kāi)始不要加壓，等溶解樣品的溶劑和樣品層有一段距離（2~4 cm），再加壓，這樣避免了溶劑（如二氯甲烷等）夾帶樣品快速下行。
很多樣品在上柱前粘性較大，上樣后在柱上又會(huì )析出，這一般都是比較大量的樣品才會(huì )出現，是因為填料對樣品的吸附飽和所致。有些樣品溶解性差，能溶解的溶劑（比如DMF，DMSO等）又不能上柱，這樣就必須用干法上柱了。
6. 淋洗液的收集和濃縮
用硅膠作固定相過(guò)柱子的原理是一個(gè)吸附與解吸的平衡。如果樣品與硅膠的吸附比較強的話(huà)，就不容易流出，這時(shí)可以采用氧化鋁作固定相。
柱層析后的淋洗液，由于使用了較多的溶劑，必須進(jìn)行濃縮，如果待測物具有一定的揮發(fā)性，最好使用常壓揮發(fā)溶劑，否則易導致檢測結果偏低。
