定量蛋白質(zhì)組學(xué)的方法學(xué)介紹
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發(fā)布時(shí)間：2016-10-06
1 背景和意義
從生命活動(dòng)的直接執行者——蛋白質(zhì)的角度研究生命現象和規律（特別是疾病防治和病理研究）已成為研究生命科學(xué)的主要手段。而這些研究往往離不開(kāi)對細胞、組織或器官中含有蛋白質(zhì)種類(lèi)和表達量的研究。對處不同時(shí)期、不同條件下蛋白質(zhì)表達水平變化的研究，識別功能模塊和路徑，監控疾病的生物標志物，這些研究都需要對蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和定量。生物質(zhì)譜技術(shù)的出現和不斷成熟為蛋白質(zhì)差異表達分析提供了更可靠、動(dòng)態(tài)范圍更廣的研究手段?；谫|(zhì)譜技術(shù)，科學(xué)家們不斷開(kāi)發(fā)出新的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法，來(lái)了解細胞、組織或生物體的整體蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)。
2 方法學(xué)介紹
目前較主流的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法有5種，分別是Label-free、iTRAQ、SILAC、MRM(MRMHR)、和SWATH。簡(jiǎn)述如下：
2.1 Label-free
Label-free定量，即非標記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)，不需要對比較樣本做特定標記處理，只需要比較特定肽段/蛋白在不同樣品間的色譜質(zhì)譜響應信號便可得到樣品間蛋白表達量的變化，通常用于分析大規模蛋白鑒定和定量時(shí)所產(chǎn)生的質(zhì)譜數據。
Label-free定量不需要標記處理，操作簡(jiǎn)單，可以做任意樣本的總蛋白質(zhì)差異定量，但對實(shí)驗操作的穩定性、重復性要求較高，準確性也較標記定量差。因此，Label-free技術(shù)適合于大樣本量的定量比較，以及對無(wú)法用標記定量實(shí)現的實(shí)驗設計。
2.2 iTRAQ
iTRAQ定量是目前定量蛋白質(zhì)組學(xué)應用最廣泛的技術(shù)， 該技術(shù)的核心原理是多肽標記和定量，將多肽的含量轉化為114、115、116和117同位素的含量(或113、114、115、116、117、118、119和121的8標記)，從而簡(jiǎn)化了定量的復雜性，最終通過(guò)多肽定量值回歸到蛋白的定量值，從而最終測定出不同樣本之間蛋白質(zhì)的差異。
iTRAQ定量不依賴(lài)樣本，可檢測出較低豐度蛋白，胞漿蛋白、膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白等，且定量準確，可同時(shí)對8個(gè)樣本進(jìn)行分析，并可同時(shí)得出鑒定和定量的結果，特別適用于采用多種處理方式或來(lái)自多個(gè)處理時(shí)間的樣本的差異蛋白分析。金開(kāi)瑞質(zhì)譜平臺應用iTRAQ定量技術(shù)，可鑒定多達6000種蛋白（以人HepG2為例），重復樣品間的蛋白表達量相關(guān)性可達到0.95以上。
2.3 SILAC
SILAC定量的基本原理是分別用天然同位素(輕型)或穩定同位素(中性或重型)標記的必需氨基酸取代細胞培養基中相應氨基酸，細胞經(jīng)5-6個(gè)倍增周期后，穩定同位素標記的氨基酸完全摻入到細胞新合成的蛋白質(zhì)中替代了原有氨基酸。不同標記細胞的裂解蛋白按細胞數或蛋白量等比例混合，經(jīng)分離、純化后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，根據一級質(zhì)譜圖中兩個(gè)同位素型肽段的面積比較進(jìn)行相對定量，屬于體內代謝標記法。
SILAC屬于體內標記技術(shù)，更接近樣品真實(shí)狀態(tài)，標記效率高達100%，且標記效果穩定，不僅適合于進(jìn)行全細胞蛋白分析，還適合于膜蛋白的鑒定和定量，每個(gè)樣本只需要幾十微克的蛋白量。SILAC定量適用于活體培養細胞的分析，對多個(gè)樣品或同一樣品不同條件下全細胞蛋白或亞細胞蛋白進(jìn)行差異比較。
2.4 MRM和MRMHR
MRM是一種基于已知信息或假定信息設定質(zhì)譜檢測規則，對符合規則的離子進(jìn)行信號記錄，去除大量不符合規則離子信號的干擾，從而得到質(zhì)譜信息的一種數據獲取方式，屬于目標蛋白質(zhì)組。其關(guān)鍵在于首先要能夠檢測到具有特異性的母離子，然后只將選定的特異性母離子進(jìn)行碰撞誘導，最后去除其他子離子的干擾，只對選定的特異子離子進(jìn)行質(zhì)譜信號的采集。金開(kāi)瑞依據前人的工作在A(yíng)BSCIEX的5600-plus 儀器上開(kāi)發(fā)出了MRMHR技術(shù)，因為MRMHR采納了高精度的數據，因此選擇Transition更加可信，定量更加準確。
MRMHR技術(shù)通過(guò)兩級離子選擇，排除大量干擾離子，使質(zhì)譜的化學(xué)背景降低，目標檢測物的信噪比顯著(zhù)提高，從而實(shí)現檢測的高靈敏度，并具有重現性好、準確度高等特點(diǎn)，特別適合于已知蛋白質(zhì)序列的蛋白質(zhì)表達量差異驗證，可以檢測較低豐度的蛋白，但一次MRM實(shí)驗只能檢測到20個(gè)左右的目標蛋白。
2.5 SWATH
SWATH是瑞士蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院的Ruedi Aebersold 博士及其團隊與AB-SCIEX于2012年聯(lián)合推出的一項全新的質(zhì)譜采集模式技術(shù)，是MS/MSALL技術(shù)的一種擴展。與傳統的shot-gun技術(shù)相比，SWATH采集模式能夠將掃描區間內所有的肽段母離子經(jīng)過(guò)超高速掃描并進(jìn)行二級碎裂，從而獲得完整的肽段信息，是一種真正全景式的、高通量的質(zhì)譜技術(shù)。金開(kāi)瑞現有的Triple-TOF 5600-plus質(zhì)譜系統，使SWATH定量具有較高的準確度和動(dòng)態(tài)范圍，可檢測到蛋白質(zhì)的豐度差異極大，跨越4個(gè)數量級。
應用SWATH采集模式，一次實(shí)驗即可獲得完整的定量與定性結果，無(wú)需進(jìn)行方法優(yōu)化。它可以采集樣品中所有化合物的信息，可以對所有化合物進(jìn)行追溯、查詢(xún)和分析。定量方法采用高分辨模式，可以消除干擾，提高選擇性，且定量能力可與三重四級桿質(zhì)譜相媲美，靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍與SRM分析水平相當。針對亞細胞結構、細菌、真菌、細胞分泌物等樣本，SWATH定量的效果非常好。
3 結語(yǔ)
蛋白質(zhì)組學(xué)是對一個(gè)細胞或組織所表達的蛋白質(zhì)進(jìn)行的系統分析，分析技術(shù)包括分離蛋白質(zhì)和肽的分離科學(xué)、識別和定量分析物的分析科學(xué)和數據管理和分析的生物信息學(xué)，質(zhì)譜是其關(guān)鍵性分析工具。同樣的技術(shù)現在已經(jīng)被作為普遍的發(fā)現工具來(lái)動(dòng)態(tài)檢測一個(gè)細胞或組織對外來(lái)或內部干擾反應而在蛋白質(zhì)組中的改變，即定量蛋白質(zhì)組學(xué)。針對不同的樣本，不同的實(shí)驗分析目的，可選擇不同的定量分析技術(shù)。
