蛋白樣品的定量
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發(fā)布時(shí)間：2016-10-18
目前常用比色法測定樣品蛋白的含量：Bradford法（考馬斯亮藍法）、Lowry法（Folin-酚試劑法）、 BCA法等。但各有優(yōu)缺點(diǎn)，大家可以根據具體情況選取。按相應蛋白質(zhì)定量試劑盒操作說(shuō)明操作，測定樣品濃度。
收集完蛋白樣品后，為確保每個(gè)蛋白樣品的上樣量一致，需要測定每個(gè)蛋白樣品的蛋白濃度。根據所使用的裂解液的不同，需要采用適當的蛋白濃度測定方法。因為不同的蛋白濃度測定方法對于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大，大家可以根據具體情況選取。
Bradford法（考馬斯亮藍法）:
考馬斯亮藍G-250有紅、藍兩種不同顏色的形式，在一定濃度的乙醇和酸性條件下，可配成淡紅色的溶液，與蛋白結合后形成藍色化合物，該化合物在595 nm處有最大吸收值，化合物顏色深淺與蛋白的濃度高低成正比。
該法操作簡(jiǎn)便迅速，消耗樣品量少，但不同蛋白質(zhì)之間差異大，且標準曲線(xiàn)線(xiàn)性差。高濃度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸銨和去污劑對測定有干擾。緩沖液濃度過(guò)高時(shí)，改變測定液pH值會(huì )影響顯色。
Lowry法（Folin-酚試劑法）:
福林-酚試劑（Folin-phenol reagent）的顯色原理是：首先在堿性條件下蛋白質(zhì)與銅作用生成蛋白質(zhì)-銅復合物，該復合物隨之將磷鉬酸-磷鎢酸還原成藍色復合物。在一定條件下，藍色強度與蛋白質(zhì)量成正比，蛋白質(zhì)濃度范圍約在25～250 μg/mL。
雖然該法是測定蛋白質(zhì)濃度應用最廣泛的方法之一，但其缺點(diǎn)也很明顯，專(zhuān)一性較差，干擾物質(zhì)多（如Tris緩沖劑、蔗糖、硫酸銨、巰基化物、酚類(lèi)、檸檬酸等），標準曲線(xiàn)的直線(xiàn)關(guān)系不特別嚴格。因此在其應用過(guò)程中有很多新的修正。
BCA法（二喹啉甲酸法）:
二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid，BCA ）法是Lowry測定法的一種改進(jìn)方法，是近來(lái)廣為應用的蛋白定量方法。其原理與Lowery法蛋白定量相似，即在堿性條件下蛋白質(zhì)分子中的肽鍵能與Cu2+絡(luò )合生成絡(luò )合物，同時(shí)將Cu2+還原成Cu+。二喹啉甲酸及其鈉鹽是一種溶于水的化合物，在堿性條件下，可以和Cu+結合形成穩定的紫藍色復合物，在562 nm處有高的光吸收值，并且化合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，據此可測定蛋白質(zhì)濃度。
與Lowery法相比，BCA蛋白測定方法操作更簡(jiǎn)單，試劑及其形成的顏色復合物穩定性更好，幾乎沒(méi)有干擾物質(zhì)的影響，靈敏度高（微量檢測可達到0.5 μg/ml），應用更加靈活。與Bradford法相比，BCA法的顯著(zhù)優(yōu)點(diǎn)是不受去垢劑的影響。
BCA法與Lowry法都容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。Bradford 法敏感度最高，且與一系列干擾Lowry，BCA 反應的還原劑（如DTT，巰基乙醇）相容。但是對于去污劑依然是敏感的，其最主要的缺點(diǎn)是不同的標準品會(huì )導致同一樣品的結果差異較大，無(wú)可比性。
