激光掃描共聚焦顯微鏡操作步驟及注意事項
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發(fā)布時(shí)間：2016-11-09
激光掃描共聚焦顯微鏡操作步驟及注意事項
激光掃描共聚焦顯微鏡可測定的樣品種類(lèi)很多．包括生物材料、組織(切片)、細胞(亞細胞)結構等。樣品中熒光的來(lái)源主要有如下幾種：自發(fā)熒光(autofluorescence)、熒光染色、免疫熒光、熒光蛋白、誘發(fā)熒光(induced fluorescence)及酶致熒光(enzymatically produced fluorescence)等等。其中大部分熒光素的激發(fā)和發(fā)射波長(cháng)均可在儀器自帶軟件的染料信息庫中找到。
1．觀(guān)察步驟及儀器操作 根據實(shí)驗要求制備樣品完畢后。即可進(jìn)行觀(guān)察?；静襟E如下：
(1)開(kāi)啟儀器電源及光源：一般先開(kāi)啟顯微鏡和激光器，再啟動(dòng)計算機，然后啟動(dòng)操作軟件，設置熒光樣品的激發(fā)光波長(cháng)，選擇相應的濾光鏡組塊。以便光電倍增管(photo multiplier tube，PMT)檢測器能得到足夠的信號結果。使用汞燈的注意事項同普通熒光顯微鏡。
(2)設置相應的掃描方式：在目視模式下．調整所用物鏡放大倍數，在熒光顯微鏡下找到需要檢測的細胞。切換到掃描模式，調整雙孔針和激光強度參數，即可得到清晰的共聚焦圖像。
(3)獲取圖像：選擇合適的圖像分辨率，將樣品完整掃描后，保存圖像結果即可。
(4)關(guān)閉儀器：儀器測定樣品結束后，先關(guān)閉激光器部分，計算機仍可繼續進(jìn)行圖像和數據處理。若要退出整個(gè)激光掃描共聚焦顯微鏡系統．則應該在激光器關(guān)閉后，待其冷卻至少10分鐘后再關(guān)閉計算機及總開(kāi)關(guān)。
2．獲取三維圖像 激光掃描共聚焦顯微鏡具有細胞“CT”功能，因此，它可以在不損傷細胞的情況下，獲得一系列光學(xué)切片圖像。選用“Z-Stack"模式，即可實(shí)現此項功能。其基本步驟是：
①開(kāi)啟“Z-Stack”選項；
②確定光學(xué)切片的位置及層數；
③啟動(dòng)“Start”，獲得三維圖像。
3．獲取時(shí)間序列圖像 共聚焦顯微鏡的"Time-Series"功能，可以自動(dòng)在實(shí)驗者規定的時(shí)間內按照設定的時(shí)間間隔獲取圖像。只需設定所需的時(shí)間間隔以及所需圖像數量，開(kāi)啟“Start T”功能鍵，即可進(jìn)行實(shí)驗?！癟ime-Series"功能大大減輕了實(shí)驗者的勞動(dòng)強度，對于熒光漂白恢復和鈣離子成像等實(shí)驗非常實(shí)用。
4．注意事項及維護保養
(1)儀器周?chē)h離電磁輻射源；
(2)環(huán)境無(wú)震動(dòng)，無(wú)強烈的空氣擾動(dòng)；
(3)室內具有遮光系統，保證熒光樣品不會(huì )被外源光漂白；
(4)環(huán)境清潔；
(5)控制工作溫度在5～25℃。
