①將蛋白電泳后的凝膠浸入電轉緩沖液中15min。

       ②將電轉膜（醋酸纖維素膜）先在甲醇中浸泡至完全濕潤（甲醇用于活化電轉膜上的基團，可能是使得膜上的正電性增強），然后再將膜浸入超純水中5min，最后再將膜浸入電轉液中15min。

       ③濾紙先在電轉液中完全浸濕，然后將濾紙平鋪在電轉纖維上，在濾紙正上方平鋪凝膠，在凝膠正上方平鋪電轉膜，在電轉膜正上方平鋪濾紙，最后用玻棒趕氣泡。（注：濾紙一定要比電轉膜略小，也可比凝膠略小，最好與凝膠大小一致；電轉膜應與凝膠大小一致或略大；理論上，電轉膜的大小只要能夠覆蓋住目標區域即可）。

        ④100V，電轉100min。（注：電轉儀置于冰浴中，并且電轉儀中還要放入攪拌子；注意電轉時(shí)的正負極，黑色朝向黑色）。

        ⑤電轉結束后，將電轉膜浸泡于甲醇中5min，最后將電轉膜浸泡于4ml 10%的牛奶（2g奶粉溶于20ml超純水）中（5%BSA），置于37℃搖床（75rpm）封閉1.5h（也可4℃封閉過(guò)夜）。

      （注1：若采用預覽的Marker可以在轉膜結束后看到Marker條帶是否轉移到膜上，據此判斷蛋白條帶是否轉移到膜上，因此可省略麗春紅浸泡觀(guān)察等過(guò)程，直接封閉。

        注2：不論是封閉還是后面的加一抗和二抗，都要將自封袋中的氣泡趕走，尤其是大氣泡，因為大氣泡的存在阻隔了牛奶、一抗和二抗與膜的接觸，不利一抗與二抗的接觸，導致后面顯色不明顯；搖床轉速不能太快，否則會(huì )一抗與二抗即使結合了又會(huì )被甩分開(kāi)）。

        ⑥封閉1.5h結束后，電轉膜用PBST溶液（1L 1×PBS溶液+500ulTween-20，注意Tween粘度較大，吸取時(shí)要慢，否則吸不夠量；同樣地，打出時(shí)也要慢，否則會(huì )沒(méi)有全部打出）洗3次，每次10min。

        ⑦將電轉膜浸入一抗溶液中，置于37℃搖床，75rpm，1.5h（一抗溶液的制備：10ml的10%脫脂牛奶或BSA溶于PBST中+5-10ul一抗，即共稀釋了1000-2000倍，可根據需要自行設計抗體稀釋倍數）。

        ⑧一抗溶液浸泡結束后，將電轉膜用PBST溶液洗3次，每次10min。

        ⑨將電轉膜浸入二抗溶液中，置于37℃搖床，75rpm，1h（二抗溶液的制備同一抗）。

        ⑩二抗溶液浸泡結束后，將電轉膜用PBST溶液洗3次，每次10min。洗完后，將膜浸泡于底物溶液中顯色，顯色結束后，用濾紙吸干膜上的水分，將膜置于凝膠成像儀中用白光拍照。電轉膜用保鮮膜包裹保存（有時(shí)顯色時(shí)間過(guò)長(cháng)，導致背景顏色較深，則拍照時(shí)可將電轉膜反過(guò)來(lái)拍背面）。

         注：凝膠和電轉膜都要用剪刀剪去一角用以定位。