實(shí)驗概要 運用LOWRY法測定蛋白質(zhì)的含量。
實(shí)驗原理
Lowry法是雙縮脲法和福林酚法的結合與發(fā)展，其原理是：蛋白質(zhì)溶液用堿性銅溶液處理，形成銅-蛋白質(zhì)的絡(luò )合鹽，再加入酚試劑后，除使肽鏈中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等顯色外，還使雙縮脲法中肽鍵、堿性銅的顯色效果更強烈。因此，Lowry法的顯色效果比單獨使用酚試劑強烈3～15倍，為雙縮脲法100倍。由于肽鍵顯色效果增強，從而減小了因蛋白質(zhì)種類(lèi)引起的偏差。
Lowry法的試劑由兩部分組成，試劑甲相當于雙縮脲試劑（堿性銅溶液），可與蛋白質(zhì)中的肽鍵起顯色反應；試劑乙為磷鎢酸和磷鉬酸混合液，在堿性條件下極不穩定，易被酚類(lèi)化合物還原生成鉬藍和鎢藍混合物而呈藍色反應，因此蛋白質(zhì)的酪氨酸和胱氨酸等可顯色，顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。
主要試劑
Na2WO4?2H2O；Na2MoO4?2H2O；85% H3PO4；濃HCl；Li2SO4?H2O；溴水；酚酞指示劑；Na2CO3；NaOH；CuSO4?5H2O；酒石酸鉀鈉；
牛血清白蛋白：用水配成250mg/ml。
主要設備
試管若干；刻度吸管0.5ml，1ml，10ml；定量加樣器；圓底燒瓶；冷凝管一套（帶橡膠管）；微量滴定管；小燒杯；微量進(jìn)樣器50μl；分光光度計。
實(shí)驗材料
可溶性蛋白質(zhì)
實(shí)驗步驟
1. 酚試劑的制備
（1）取Na2WO4?2H2O 100g，Na2MoO4?2H2O 25g 及蒸餾水700ml于1500ml的圓底燒瓶中，之后加入85% H3PO4 50ml，濃HCl 100ml。安上回流冷卻裝置（使用磨口接頭。用軟木塞或橡皮塞時(shí)，必須用錫泊包起來(lái)），使其慢慢沸騰10h。冷卻后加入Li2SO4?H2O 150g，水50ml，濃HCl 100ml安上回流冷卻裝置，開(kāi)口加熱煮沸15min，以逐出過(guò)量的溴。冷卻后稀釋至100ml，并過(guò)濾入棕色瓶中，密閉于冰箱中保存。
使用時(shí)用標準NaOH溶液滴定，以酚酞為指示劑。滴定終點(diǎn)由藍變灰。滴定后算出酸濃度，用時(shí)適量稀釋?zhuān)棺詈鬂舛葹?mol/L H＋，此為Folin-酚試劑乙液。
（2）首先配制①4% Na2CO3溶液；②0.2mol/L NaOH溶液；③1% CuSO4溶液；④2%酒后石酸鉀鈉溶液；使用前①與②等體積混合配成Na2CO3-NaOH溶液；將③與④等體積混合配成硫酸銅一酒石酸鉀鈉溶液。然后將這兩個(gè)溶液按50︰1混合；配成Folin-酚試劑甲液。此試劑只能用一天。
2. 標準曲線(xiàn)的繪制
（1）取7只試管編號,分別加0ml，0.1ml，0.2ml，0.4ml，O.6ml，0.8ml，1.0ml標準蛋白質(zhì)溶液，用水補到1ml，便成為每管含蛋白為0mg，25mg，50mg，100mg，150mg，200mg，250mg標準系列（必要時(shí)可做重復）。
（2）加5ml試劑甲，混勻，于30℃放置10min。
（3）噴射加入0.5ml試劑乙，立即振蕩混勻，在30℃下保溫30min。
（4）準確到30分后，以不加標準蛋白的管為空白，在500nm波長(cháng)下比色測定吸光度值。
（5）以蛋白濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線(xiàn)。
3. 樣品測定
（1）取50μl樣液加入試管中，（樣液提取一般按0.1g鮮樣/ml比例，提取方法見(jiàn)各酶活測定）加蒸餾水補至1ml，然后重復步驟2的（2），（3），（4），以空白為參比，測吸光度值。
（2）根據吸光度值，查標準曲線(xiàn)求得蛋白質(zhì)含量。
4. 結果計算
蛋白質(zhì)含量（mg/g鮮重）＝ (C*V/a)/W式中 C－查標準曲線(xiàn)得樣品測定管中蛋白質(zhì)含量（mg）；
V－提取液總量（ml）；
a－測定時(shí)取樣液量（ml）；
W－取樣量（g）。
注意事項
1. Folin試劑乙只在酸性條件穩定，故當其加到堿性的銅-蛋白質(zhì)溶液中時(shí)，必須立即混勻，以便在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞前，還原反應即能發(fā)生。
2. 為了保證反應進(jìn)行完全，反應在25～30℃水浴中進(jìn)行，反應30min后準時(shí)比色。
3. 還原物質(zhì)干擾本實(shí)驗。
考馬斯亮藍法和LOWRY法兩種方法均是靈敏度為微克級的高靈敏度定量測定蛋白質(zhì)方法，前者穩定，后者簡(jiǎn)便；二者均優(yōu)于現有的其它方法。
二者的缺點(diǎn)是：
1. Lowry法受植物體內存在的酚類(lèi)物質(zhì)干擾；
2. 考馬斯亮藍法在蛋白質(zhì)含量很高時(shí)線(xiàn)性關(guān)系稍偏低，且不同蛋白質(zhì)與色素結合狀況有差異。
