細菌DNA提取方案：革蘭氏陰性菌，如E.coli，一般有三種可以選擇的方法。

一、水煮模板法——主要用于PCR反應


      1、接種單菌落于LB或腦心平板，連續畫(huà)線(xiàn)，37攝氏度培養18－24小時(shí)。


      2、刮取1～2接種環(huán)菌苔加入150微升三蒸水中，混勻，100攝氏度煮沸10分鐘。


      3、12000轉/分鐘 離心10分鐘，取上清，－20攝氏度保存備用。


      操作最簡(jiǎn)便，對試劑條件要求低。缺點(diǎn)是純度不夠高，可能會(huì )含有RNA、蛋白等雜質(zhì)。但是作為一般檢測目的的PCR反應模板已經(jīng)足夠了。


      有人稱(chēng)擴增4kb以下片段都可用此種方法制取模版，編者用此類(lèi)模板PCR可以擴增到3500bp的片段。編者建議：此法得到的模版保存時(shí)間短，強烈建議每月重新制作一次。


二、CTAB/NaCl 法


      1、接種一單菌落于5mlLB中,30℃培養過(guò)夜,


      2、取1ml種子培養液接入100ml2%LB中,37℃、220r/min培養16小時(shí);


      3、5000r/min離心10分鐘,棄去上清。


      4、加入10mlTE離心洗滌后,用10mlTE溶解菌體,混勻,-20℃保存備用。


      5、取3.5ml菌懸液,加入184μl10%SDS,混勻,加入37μl10mg/ml蛋白酶K,混勻,37℃溫育1小時(shí)


      6、加入740μl5mol/LNaCl,再加入512μlCTAB/NaCl,混勻,65℃溫育10分鐘。


      7、加入等體積的氯仿/異戊醇,混勻,10000r/min離心5分鐘,保留上清。


      8、上清中加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1),混勻,10000r/min離心5分鐘,保留上清。


      9、加入0.6倍的異丙醇,混勻,10000r/min離心5分鐘,收集DNA沉淀,用70%乙醇離心洗滌DNA沉淀。


      10、用1mlTE溶解DNA,加入終濃度為20μg/mlRNaseA,4℃保存。


      CTAB/NaCl法提取的DNA純度較高，蛋白雜質(zhì)較少，保存時(shí)間長(cháng)，編者更喜歡把終濃度為20μg/ml RnaseA加在第5步溫育的時(shí)候，這樣最后沒(méi)有RnaseA污染。每一步操作細致一些，得到的DNA可用于Southern blot。
      編者建議：長(cháng)時(shí)間保存DNA可放于-20℃，但要盡量減少反復凍融，否則影響DNA質(zhì)量。


三、鹽析法


      1、1.5ml對數期菌液


      2、12000rpm 30 s


      3、200ul裂解液（同CTAB/NaCl法），37c,1hr


      4、66ul 5M NaCL,混勻充分，12000rpm 10min


      5、上清用粗槍頭取至新管


      6、等體積酚充分混勻，12000rpm 3min，反復抽提至無(wú)蛋白層


      7、取水層，等體積氯仿混勻，12000rpm 3min


      8、上清至新管，2倍體積預冷無(wú)水乙醇


      9、-20C，20min，14000rpm， 15min


      10、400ul 70%冷乙醇洗滌


      11、干燥，100ul 20ug/ml RNaseA，37C，30min


      12、2倍體積無(wú)水乙醇沉淀，70%冷乙醇洗滌


      13、干燥，溶于100ul TE


      介于方法一和方法二之間，CTAB雖然取出糖分效果較好，但CTAB本身也是有毒的，所以此方法放棄了CTAB。


      革蘭氏陽(yáng)性菌，由于細胞壁的結構與陰性菌有差別，裂解比陰性菌稍微麻煩一些，可以采取CTAB/NaCl法稍加修改，在第四步加入終濃度2mg/ml的溶菌酶，37度溫育1h。

      實(shí)驗注意：提基因組最好要將槍頭尖剪掉（剪掉以后在酒精燈上迅速過(guò)一下，使其斷口圓滑）。以免槍頭損傷基因組！抽干時(shí)最好是風(fēng)干！

      （本文轉載：丁香通）