一、將小室放入培養板中，在上室加入300 μl預溫的無(wú)血清培養基，室溫下靜置15－30 min，使基質(zhì)膠再水化。再吸去剩余培養液。

二、制備細胞懸液

      ① 制備細胞懸液前可先讓細胞撤血清饑餓12－24 h，進(jìn)一步去除血清的影響。但這一步并不是必須的。

三、接種細胞

      ① 取細胞懸液100－200 μl加入Transwell小室，不同公司的、不同大小的Transwell小室對細胞懸液量有不同要求，請參考說(shuō)明書(shū)。24孔板小室一般200 μl。

      ② 24孔板下室一般加入500 μl含FBS或趨化因子的培養基，不同的培養板加的量有不同要求，具體請參考說(shuō)明書(shū)。這里要特別注意的是，下層培養液和小室間常會(huì )有氣泡產(chǎn)生，一旦產(chǎn)生氣泡，下層培養液的趨化作用就減弱甚至消失了，在種板的時(shí)候要特別留心，一旦出現氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進(jìn)培養板。

      時(shí)間過(guò)長(cháng)不可以，同樣，過(guò)短也不行，因為細胞內會(huì )有一定量的MMPs儲存，短時(shí)間內可能侵襲能力不會(huì )有太大改變。同時(shí)從藥物被吸收進(jìn)去，進(jìn)而發(fā)揮作用，影響MMPs表達，到最后釋放到培養基中，還需要一個(gè)過(guò)程。時(shí)間點(diǎn)的選擇可盡量長(cháng)點(diǎn)，也可選擇多個(gè)時(shí)間點(diǎn)研究時(shí)間依賴(lài)效應，但前提是這個(gè)時(shí)間范圍內細胞數目不能有明顯變化。另外，我看到細胞在小室內的形態(tài)不是正常培養貼壁的形態(tài)，而是圓形的，仍是懸浮時(shí)的形態(tài)，不過(guò)會(huì )聚集成團，所以看到細胞不正常貼壁也不要緊張，是正?，F象

      在培養過(guò)程中，膜下會(huì )逐漸有少量小氣泡產(chǎn)生，這是正?，F象，可不予處理，但我遇到過(guò)培養一段時(shí)間后，膜下出現了大氣泡，幸虧及時(shí)發(fā)現，否則后果將非常嚴重。因此，個(gè)人建議，最好接種細胞后1－2 h把培養板從培養箱里拿出來(lái)看看，確信沒(méi)有大氣泡產(chǎn)生。

      （本文轉載于：丁香通）