原理

　　微核試驗是一種快速的方法，可檢測干擾細胞有絲分裂的染色體損傷或化學(xué)毒物。微核是存在于細胞主核之外的顆粒。大小對應于孔直徑的1/20至1/5、它具有圓形或杏仁形。其染色與細胞核一致。在相間細胞中發(fā)現。顯示一個(gè)或多個(gè)。由于細胞染色體的破壞或紡錘絲的影響，微核通常被認為是有絲分裂后期保留在核外的遺傳物質(zhì)。因此，微核試驗可以檢測由化學(xué)毒素或物理因素引起的染色體完整性改變和染色體分離改變的遺傳終點(diǎn)。微核可以出現在多種細胞中，但是在有核細胞中，很難將它們與正常的核葉和神經(jīng)突區分開(kāi)。在成熟前最后一次分離后數小時(shí)，紅細胞可以排泄主核，但它們保留PCE細胞中的微核，因此通常要對PCE細胞中的微核進(jìn)行計數。

　　設備試劑

　　1設備手術(shù)刀，手術(shù)剪刀，無(wú)牙鉗，彎曲小止血鉗，干凈的紗布，帶橡膠尖的吸管，臺式離心機，帶刻度的離心管，干燥架，吹風(fēng)機，玻璃蠟筆，玻璃染缸，2 ml注射器和針頭，玻璃滑動(dòng)器和推桿，時(shí)鐘，帶油鏡的顯微鏡，細胞計數器。

　　2種試劑甲醇（分析純），甘油（分析純），小牛血清，鹽水，吉姆薩原液（吉姆薩染料1克，甘油66毫升，甲醇60毫升。首先在研缽中收集染料。加入少量甘油，混合并研磨，將剩余的甘油分批倒入，繼續研磨，然后轉移到燒杯中，蓋上玻璃觀(guān)察杯，在60°C的水浴中放置2小時(shí)，取出并冷卻，加入甲醇，混合，放置2周，然后在陰涼處儲存，同時(shí)通過(guò)棕色瓶過(guò)濾，儲液儲存時(shí)間越長(cháng)，染色效果越好pH值為6.8的磷酸鹽緩沖液使用該溶液制備10％的涂料溶液），磷酸鹽緩沖液pH 6.8。

　?。?）I/15mol/L磷酸二氫鉀（KH2PO4）溶液：稱(chēng)量049.06g KH2P04（分析純），溶于蒸餾水并稀釋至1000ml。

　?。?）1/15mol/L磷酸氫二鈉（Na2HPO4）溶液：分析純的Na2HPO4、9.45g（或Na2HPO4？2H2011.87g;

　　a2HPO4？7H2017.87g;a2HPO4？12H2023.88g ）重量溶于蒸餾水，稀釋至1000毫升。

　?。?）pH 6.8磷酸鹽緩沖液：取50.40 ml的1/15 mol/L磷酸二氫鉀溶液和49.60 ml的1/15 mol/L磷酸氫二鈉溶液，將兩者混合均勻將會(huì )給予。

　　3、陽(yáng)性對照是環(huán)磷酰胺或絲裂霉素C。

　　操作步驟

　　1、試驗動(dòng)物和治療方法（1）動(dòng)物選擇：常用的試驗動(dòng)物是大鼠和小鼠。小鼠使用最廣泛，體重在18至20克之間，年齡在7至12周之間。每組有10只小鼠，雄性一半，雄性一半。

　?。?）接觸途徑：根據研究目的或所測試化學(xué)毒物的性質(zhì)，可以選擇口服，皮膚，呼吸和注射途徑。但原則上，應盡可能使用與人體接觸化學(xué)毒物相同的方法。

　?。?）接觸次數和采樣時(shí)間：研究證實(shí)，化學(xué)毒物需要以特定濃度在靶器官中積累才能產(chǎn)生誘變作用。由不同化學(xué)毒物引起的微核峰時(shí)間也不同。波動(dòng)范圍可以達到24到72小時(shí)。這就要求在接觸化學(xué)毒物后設置不同的采樣時(shí)間點(diǎn)?？紤]到上述兩個(gè)原因，建議使用多次曝光。其中，4次曝光更方便合理。也就是說(shuō)，連續4天和5天每天采樣一次。這樣，采樣時(shí)間可以覆蓋24到72小時(shí)的峰值。如果高峰延遲了96個(gè)小時(shí)，您將不會(huì )錯過(guò)。 （4）劑量選擇：除溶解度限制外，所測試化學(xué)毒物的最大劑量應達到最大耐受劑量。通常，有3至5個(gè)或更多劑量組，并且劑量覆蓋范圍應達到3位數或更多。同時(shí)，應建立陽(yáng)性對照組和陰性對照組?？梢越o陽(yáng)性對照組進(jìn)行一次或兩次腹膜內注射環(huán)磷酰胺（50-100 mg/kg）或絲裂霉素C（10 mg/kg）。陰性對照組使用相同量的溶劑。

　　2、骨髓液的制備和涂片最后，用毒物感染試驗動(dòng)物后，根據確定的時(shí)間通過(guò)頸脫位或麻醉將其殺死，將四肢固定在解剖板上，將腹部的中線(xiàn)附著(zhù)在頭發(fā)上，并切開(kāi)胸部。腹部說(shuō)。取出胸骨，擦去血液，除去肌肉，切斷骨phy，然后用彎曲的小止血劑在干凈的載有小牛血清滴的載玻片上擠壓骨髓，充分混合后再滑動(dòng)。按。殺死動(dòng)物后，用手術(shù)剪刀快速去除兩條腿的股骨，去除肌肉，用鹽水沖洗血液和碎肉，切掉兩端的骨頭，并去除2 ml的骨頭。使用注射器連接針頭并吸取小牛血清。插入骨髓腔，將骨髓倒入離心管中，用移液管將骨髓團勻漿，以1000/min的速度離心10分鐘，棄去多余的上清液，留下約0.5 ml與沉淀物混合的滴管用于在干凈的玻璃載玻片上繪制水滴并將其按下。陽(yáng)性和陰性對照組如上所述同時(shí)治療。

　　3、將固定和干燥的骨髓切片放入染色罐中，用甲醇溶液固定15分鐘，取出并干燥。無(wú)法及時(shí)染色的涂片也需要糾正和保存。

　　4、固定并干燥后，將涂片染色并準備新鮮的涂片。用Giemsa涂料溶液（1份Giemsa儲備液+ 9份pH 6.8磷酸鹽緩沖液）染色10至15分鐘后，在載玻片上漂洗染色溶液并將其放在干燥架上干燥。

　　5、首先在低倍顯微鏡下觀(guān)察和計數，然后選擇分布均勻和染色良好的區域，然后在油鏡下觀(guān)察和計數。 PCE細胞為灰藍色，陽(yáng)性染色的紅細胞（NCE）為橙色。細胞中所含的大多數微核是圓形的，邊緣光滑且有序，發(fā)色性與核質(zhì)為紫紅色或紫羅蘭色一致。一個(gè)或多個(gè)微核可能出現在細胞內。計算包含1000個(gè)PCE的微核的PCE數量，以及包含200個(gè)細胞的PCE與NCE的比率。

　　結果的分析和評估

　　在該實(shí)驗中，僅對PCE微核進(jìn)行計數，并且微核比率以每1000個(gè)表示。每只動(dòng)物都是觀(guān)察的單位。計算每組雄性和雌性動(dòng)物的平均微核PCE。如果雌性和雄性動(dòng)物之間沒(méi)有明顯的性別差異，則可以將計算結果進(jìn)行合并。否則，必須分別執行計算。正常的PCE/NCE比率約為1（正常范圍為0.6-1.2）。小于0.1的比率意味著(zhù)PCE的形成被顯著(zhù)抑制，所測試的化學(xué)毒物的量太高并且測試結果不可靠。陰性和陽(yáng)性對照中微核的發(fā)生率應與實(shí)驗中使用的物種和菌株的報告結果或研究的歷史數據相一致。測試由微核測試獲得的數據的頻率分布尚無(wú)定論，各種統計方法（泊松分布，二項式分布，X2測試等）用于測試結果的統計分析。該測試的重要步驟是良好的骨髓涂片和高質(zhì)量的染色。