一、基本概念
（一）基因導入(或基因轉導)
將外源性基因(或基因組DNA)采用分子生物學(xué)技術(shù)人工地導入細胞，觀(guān)察它在細胞中的表達，研究其生物學(xué)特性和功能，這種把基因導入細胞中的技術(shù)稱(chēng)為基因轉導(gent transfer)或稱(chēng)基因轉移，也簡(jiǎn)稱(chēng)為導入。是研究基因表達、結構和功能的重要研究手段。
（二）基因轉導的種類(lèi)：
目前基因轉導技術(shù)很多，可根據研究目的、對象和實(shí)驗條件加以選擇。
1、染色體轉導：將染色體(甚至是全套染色體)和分離提取的細胞核或DNA大分子片斷，可采用細胞融合或細胞顯微注射法將染色體或染色體片斷導入細胞內并與受體細胞(或稱(chēng)宿主細胞)發(fā)生DNA整合，研究整合的細胞特性和功能，這種轉導稱(chēng)為染色體轉導，這項技術(shù)在細胞融合和單克隆抗體雜交瘤技術(shù)中已介紹，本章從略。
2、基因轉導：將已克隆到的目的基因（或基因的DNA片斷或序列），轉導入離體細胞中進(jìn)行表達的方法稱(chēng)基因轉導，它有兩類(lèi)：一類(lèi)是將目的基因轉導入體外培養的細胞，另一類(lèi)是導入從體內取出的細胞中，觀(guān)察目的基因在細胞中表達，這項技術(shù)稱(chēng)基因轉染(gene transfection)。
體外培養的人體細胞可以是已建立的細胞系(株)包括二倍體正常細胞。如同體內細胞，如淋巴細胞、LAK細胞、TIL細胞等，基因導入后再回輸體內，已用于基因治療(gene treatment)，另一類(lèi)是將已克隆化的目的基因導入受精卵，導入基因后的受精卵植入子宮，發(fā)育成胚胎和個(gè)體，可在胚胎期和出生后觀(guān)察目的基因在整體內的表達，此項技術(shù)稱(chēng)轉基因技術(shù)（transgenic technique），轉基因技術(shù)所產(chǎn)生的動(dòng)物稱(chēng)轉基因動(dòng)物(transgenic animal)?；蜣D染的方法常用磷酸鈣法、脂質(zhì)體介導法、電擊法(電穿孔技術(shù))、DEAE葡聚糖法、細胞顯微注射法等，這均屬于物理、化學(xué)方法的轉基因技術(shù)，此法轉入至細胞內的基因一般均不與細胞染色體發(fā)生整合，而是在細胞質(zhì)呈現暫時(shí)性表達，但不持久，隨時(shí)間推移而逐漸減弱或消失，為了使目的基因進(jìn)入細胞后能與細胞基因組DNA發(fā)生整合、產(chǎn)生永久性的表達，常用病毒載體將目的基因導入細胞，并發(fā)生整合，如用逆轉錄病毒、皰疹、腺病毒等改建的病毒載體、因此基因細胞內轉導技術(shù)可歸納如下：
細胞融合技術(shù)
染色體轉導
染色體轉導(顯微注射法)
基因細胞內轉導
基因轉染 磷酸鈣沉淀法、電擊法、脂質(zhì)體法、
(體細胞)顯微注射法、逆轉錄病毒等病毒介導法
基因轉導
轉基因技術(shù)(生殖細胞)
（三）目的基因和受體細胞選擇
1、目的基因的選擇
從基因來(lái)說(shuō)，存在有功能性基因和誘發(fā)細胞轉化的基因及使癌細胞發(fā)生逆轉分化的抑癌基因，功能性基因表達時(shí)能產(chǎn)生特定的功能性蛋白，如細胞因子IFNα、IFNβ、IFNγ、IL-2～IL-18、TNFα、CSFS、EPO、TPO等有功能性基因可選用來(lái)進(jìn)行基因制藥。另一類(lèi)是誘發(fā)轉化的基因，可誘生細胞發(fā)生無(wú)限制增殖，發(fā)生永生化和惡性化的細胞轉化，因此細胞轉化試驗應選用癌基因或原癌基因。還有一類(lèi)基因可以誘導細胞分化，使腫瘤細胞逆轉向正常細胞分化。因此在研究對腫瘤細胞誘導分化時(shí)，應選用抑癌基因。細胞培養已成為研究基因、癌基因和抑癌基因表達的重要手段。
2、受體細胞的選擇
不同的受體細胞對導入后基因表達有很大影響，同樣的目的基因進(jìn)入不同的受體細胞中表達能力差異較大，有的為高表達，有的呈現低水平表達，有的甚至不能表達，如β-球蛋白基因在導入MEL14(ATCC、HB132)細胞中能促進(jìn)細胞發(fā)生分化，具有高表達功能，但導入HELA細胞中卻無(wú)表達，因此受體細胞的選擇也應引起關(guān)注?；驅爰毎蟮谋磉_與受體細胞性狀、細胞種類(lèi)和細胞來(lái)源密切相關(guān)。
此外，若目的在于獲取瞬時(shí)表達效果可采用磷酸鈣沉淀法、電擊法、脂質(zhì)體法等；若目的要獲取永久性穩定表達應選用逆轉錄病毒等病毒載體導入法。下面介紹幾種常用基因轉染方法。
二、物理化學(xué)法基因轉染技術(shù)
(一)磷酸鈣-DNA共沉淀法
核酸以磷酸鈣-DNA共沉淀物的形式出現時(shí)，可使DNA附在細胞表面，利于細胞吞入攝取，或通過(guò)細胞膜脂相收縮時(shí)裂開(kāi)的空隙進(jìn)入細胞內，進(jìn)入細胞的DNA僅有1%～5%可以進(jìn)入細胞核中，其中僅有不到1%的DNA可以與細胞DNA整合，在細胞中進(jìn)行穩定表達，基因轉導的頻率大約為10-4，這項技術(shù)能用于任何DNA導入哺乳類(lèi)動(dòng)物進(jìn)行暫時(shí)性表達或長(cháng)期轉化的研究。此方法對于貼壁細胞轉染是最常用并首選的方法。
1、配液
(1)2×HBS 1.63g NaCl
1.19g Hepes
0.023g Na2PO4、2H2O
加水至100ml pH7.1過(guò)濾，4℃保存
(2)2mmol/L CaCl2 過(guò)濾除菌
(3)TE：0.1mmol/L EDTA
1mmol/L Tris-HCL PH8.0
(4)G418(新霉素G418)液：1g G418溶于1mmol/L Hepes液中，加H2O至10mL過(guò)濾除菌4℃保存。
(5)G418選擇培養基：用含10%胎牛血清的DMEM培養液配制G418，G418濃度為200～800mg/L
注意：對受體細胞先做預試驗，選用濃度為在10～14天內能殺死細胞50%以上的最低濃度。
2、操作步驟[方法一]：
(1)供體DNA制備：方法按前介紹的DNA提取法提取，溶于TE中，40mg/L。
(2)受體細胞的培養：研究癌基因轉移應選擇不含人類(lèi)Alu序列的動(dòng)物細胞系作為受體細胞。如小鼠NIH3T3胚成纖維細胞系等，該細胞有一定自發(fā)轉化傾向，一般在轉染前一天接種細胞，接種密度為2×104/cm2,用含10%胎牛血清的DMEM液，37℃、5%CO2培養，待細胞占50～70%瓶底面積時(shí)，用于轉染試驗。
(3)DNA-磷酸鈣沉淀物的制備:
①將供體細胞DNA和PSV2-neo質(zhì)粒載體DNA用TE配制成40mg/L的DNA溶液，同時(shí)向供體細胞DNA液200μl中加入帶基因neo質(zhì)粒DNA液(20mg/L)220μl和2×HBS 250μl(PSV2-neo為1～2mg/L的使用量)。
②取500μl上述DNA溶液加入硅化試管中，緩慢加入3.1ml、2mol/L CaCl2混勻30秒。
③然后立即混旋，室溫下靜置30分鐘，待溶液輕度混濁后，吹打后即用于轉染受體細胞。
(4)轉染受體細胞:
①將處于對數生長(cháng)期已占瓶底50～70%的受體細胞，在轉染前4小時(shí)更換一次新鮮培養基，每瓶5ml（25ml培養瓶）。
②吸取0.5mLDNA-磷酸鈣沉淀，加入含5mL培養液的細胞瓶中搖勻。
③置37℃ 5% CO2培養24h或更長(cháng)，使細胞充分吸入DNA-磷酸鈣結晶顆粒。
④更換新鮮培養基，繼續培養24小時(shí)，誘導轉染基因的表達。
⑤更換濃度800mg/L的G418選擇培養液進(jìn)行篩選。同時(shí)設有未能轉染的對照細胞。
⑥培養大約3～5天，對照細胞大部分死亡，這時(shí)轉染細胞更換濃度為200mg/L的G418選擇培養基，每3～4天更換一次選擇培養基。
⑦2周后對照細胞死亡，在轉染的細胞瓶中可見(jiàn)有抗藥性的細胞克隆出現，待其增大后再進(jìn)行克隆化和擴大培養，可建立轉化細胞株，并做進(jìn)一步鑒定。
本實(shí)驗要加入PSV2-neo、DNA與外源DNA共轉染受體細胞，這樣可使受體細胞獲得新霉素(neo)基因的抗藥性，這樣即使癌基因沒(méi)有出現明顯的“轉化灶”，也可測出轉入的外源性基因的抗neo的標記。而且還可利用被neo基因導入的受體細胞通過(guò)G418選擇培養篩選轉化的細胞建立細胞株。若以獲取“轉化灶”為目的，可不加入PSV2-neo DNA只需將從癌細胞中提取的基因組DNA導入受體細胞即可，其方法如下：
3、基因組DNA轉染[方法二]：
(1)配制磷酸轉染液
NaCl 8.0g
Hepes 5.0g 用時(shí)現配，pH很重要一定要控制在6.95±0.65
Na2HPO4 0.099g 消毒滅菌 -20℃貯存備用
加溫水至 1000mL
(2)按前面介紹的方法提取癌細胞基因組DNA。
(3)取供體基因組DNA50～100μg,加3M NaCl或醋酸鈉，使最終濃度至0.3M混勻。
(4)再加2倍體積無(wú)水乙醇3000r/min離心10分鐘，去上清。
(5)加入轉染緩沖液，待DNA充分溶解后，再加入2.5MCaCl2,含最終濃度為125mM，用吸管輕輕吹打三次(不用攪拌器以防DNA袢結)，置室溫下10～30分鐘，待液體透明度降低，出現微濁蘭色時(shí)，即可用于轉染細胞。
(6)取生長(cháng)狀態(tài)良好處于半匯合階段的對數生長(cháng)期細胞，在轉染前4小時(shí)，更換培養液(5ml/瓶)1次。
(7)轉染：向每瓶中加DNA-磷酸鈣沉淀物0.5～1mL/瓶，置37℃作用4～6小時(shí)。
(8)培養：棄去培養液，用15%甘油處理3分鐘，無(wú)血清培養漂洗1次，接近匯合時(shí)血清用量降至5%，培養2～3周。
(9)檢測：逐日觀(guān)察，待出現“轉化灶”后，克隆分離，擴大培養建立轉化細胞株。
(二)脂質(zhì)體介導DNA轉染法
脂質(zhì)體(lipofectin regeant,LR)試劑是陽(yáng)離子脂質(zhì)體N-[1-2，3-Dioleyoxy, Propyl]-n, n,n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1:1(w/w)]。它適用于把DNA轉染入懸浮或貼壁培養細胞中，是目前條件下最方便的轉染方法之一。轉染率高，優(yōu)于磷酸鈣法，比它高5～100倍，能把DNA和RNA轉染到各種細胞。
用LR進(jìn)行轉染時(shí)，首先需優(yōu)化轉染條件，應找出該批LR對轉染某一特定細胞適合的用量、作用時(shí)間等，對每批LR都要做：第一，先要固定一個(gè)DNA的量和DNA/LR混合物與細胞相互作用的時(shí)間，DNA可從1～5μg和孵育時(shí)間6小時(shí)開(kāi)始，按這兩個(gè)參數繪出相應LR需用量的曲線(xiàn)，再選用LR和DNA兩者最佳的劑量，確定出轉染時(shí)間(2～24小時(shí))。因LR對細胞有一定的毒性，轉染時(shí)間以不超過(guò)24小時(shí)為宜。
細胞種類(lèi)：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一種細胞均可作為受體細胞。
1、操作步驟[方法一]：
(1)細胞培養：取6孔培養板(或用35mm培養皿)，向每孔中加入2mL含1～2×105個(gè)細胞培養液，37℃CO2培養至40%～60%匯合時(shí)(匯合過(guò)分，轉染后不利篩選細胞)。
(2)轉染液制備：在聚苯乙稀管中制備以下兩液(為轉染每一個(gè)孔細胞所用的量)A液：用不含血清培養基稀釋1-10μg DNA，終量100μL，B液：用不含血清培養基稀釋2-50μgLR，終量100μL,輕輕混合A、B液，室溫中置10-15分鐘，稍后會(huì )出現微濁現象，但并不妨礙轉染(如出現沉淀可能因LR或DNA濃度過(guò)高所致，應酌情減量)。
(3)轉染準備：用2mL不含血清培養液漂洗兩次，再加入1mL不含血清培養液。
(4)轉染：把A/B復合物緩緩加入培養液中，搖勻，37℃溫箱置6～24小時(shí)，吸除無(wú)血清轉染液，換入正常培養液繼續培養。
(5)其余處理如觀(guān)察、篩選、檢測等與其它轉染法相同。
注意：轉染時(shí)切勿加血清，血清對轉染效率有很大影響。
2、快速脂質(zhì)體轉染法操作步驟[方法二]：
(1)以5×105細胞/孔接種6孔板(或35mm培養皿)培養24小時(shí)，使其達到50～60%板底面積。
(2)在試管中配制DNA/脂質(zhì)體復合物方法如下：
①在1mL無(wú)血清DMEM中稀釋PSV2-neo質(zhì)粒DNA或供體DNA。
②旋轉1秒鐘，再加入脂質(zhì)體懸液，旋轉。
③室溫下放置5～10分鐘，使DNA結合在脂質(zhì)體上。
(3)棄去細胞中的舊液，用1mL無(wú)血清DMEM洗細胞一次后棄去，向每孔中直接加入1mL DNA/脂質(zhì)體復合物，37℃培養3～5小時(shí)。
(4)再于每孔中加入20黃的DMEM，繼續培養14～24小時(shí)。
(5)吸出DMEM/DNA/脂質(zhì)體混合物加入新鮮10黃的DMEM，2mL/孔，再培養24～48小時(shí)。
(6)用細胞刮或消化法收集細胞，以備分析鑒定。
穩定的脂質(zhì)體轉染方法如下：
(1)接種細胞同前，細胞長(cháng)至50%板底面積可用于轉染。
(2)DNA/脂質(zhì)體復合物制備轉染細胞同前(2)、(3)步驟。
(3)在每孔中加入1mL、20黃的DMEM，37℃培養48小時(shí)。
(4)吸出DMEM，用G418選擇培養液稀釋細胞，使細胞生長(cháng)一定時(shí)間，篩選轉染克隆，方法參照細胞克隆篩選法進(jìn)行。
(三)DEAE-葡聚糖轉染法
DEAE-葡聚糖介導的轉染，其原理還不清楚，可能是通過(guò)內吞噬作用而使DNA轉導進(jìn)入細胞核，此法只適合暫時(shí)轉染實(shí)驗，轉染效率與DEAE-葡聚糖濃度以及細胞與DNA/DEAE-葡聚糖混合液接觸時(shí)間的長(cháng)短很有關(guān)系，可采用較高濃度的DEAE-葡聚糖(1g/L)作用較短時(shí)間(30分鐘-1.5小時(shí))，又可用較低濃度(250g/L)的DEAE-葡聚糖作用較長(cháng)時(shí)間(8小時(shí))。方法如下：
(1)接種鼠L成纖維細胞濃度為5×105CO2/孔/皿生長(cháng)2～3天，當達50%板底面積可用。
(2)乙醇沉淀的4μg的PSV2-neo質(zhì)粒DNA，空氣干燥后溶于40μL的TE中，或取供體DNA。
(3)用10ml 1×PBS、4mL、10%富合生長(cháng)因子血清的DMEM洗板(皿)。
(4)在80μl熱的10g/L DEAE-葡聚糖中緩慢加入DNA，取120μL DNA/DEAE-葡聚糖加到每孔(皿)細胞中，使其分布均勻輕輕轉動(dòng)直到顯示均勻一致的紅色，培養4小時(shí)。
(5)從孔(皿)中吸出DNA/DEAE-葡聚糖，加入5mL 10%DMSD，室溫放置1分鐘，吸出DMSO，用5mL 1×PBS洗一次吸出，加入10mL培養液(10%血清的DMEM)。
(6)培養細胞，在適當時(shí)間分析細胞，若含有抗藥基因，可用G418選擇培養液培養，方法同前。
(四)電擊法(Electroporation)
1、原理
本法需用特殊設置(電穿孔儀)，把懸浮狀態(tài)的受體細胞和供體DNA共同放入皿中(或杯中)，再施以高壓電脈沖，能夠促進(jìn)DNA通過(guò)細胞膜而進(jìn)入胞內，并可整合到細胞的DNA中，使細胞發(fā)生轉化。如轉移的DNA為帶有選擇標記基因的質(zhì)粒，也可在選擇培養基中進(jìn)行鑒定。
2、方法
(1)DNA制備(同前)
(2)細胞：離心收獲對數生長(cháng)期細胞5×106。
(3)漂洗：吸除上清，加4℃PBS冰浴20分鐘，離心去上清。
(4)重懸：于冷4℃PBS中重懸細胞，調成5×106/ml PBS。
(5)加DNA：加入已被酶切割的DNA 1-10μg（原體積75μl），裝入電擊小室中，把小室置于電擊器中。
(6)電擊準備：接通電源，調至2000V和0.9mA極限，將瓦數和電流標度盤(pán)調到5%。
(7)電擊：接通安全開(kāi)關(guān)，使電源橫過(guò)電擊室放電，在無(wú)菌條件下，把電擊后細胞轉入培養瓶中，續加10ml培養液，置37℃CO2培養。
(8)培養：如含有標記neo基因，可按前述篩選培養法處理。
注意：上述電擊參數僅供參考，與其它方法一樣，因細胞轉染DNA不同，所需電擊條件可能需相應改變，因此為獲理想效果，以求得最佳條件。
(五)細胞顯微注射轉染法
本法是借助顯微注射器直接把DNA注射入核內，使之發(fā)生整合入受體細胞基因組中的技術(shù)。本技術(shù)需要有嚴密無(wú)菌的凈化室，以免敞開(kāi)操作污染，同時(shí)要能有自動(dòng)拉針儀以制備顯微針，一般用手動(dòng)拉針器拉制時(shí)要能使針末端有一個(gè)0.6cm長(cháng)的細部，太長(cháng)易折斷，針尖開(kāi)口為2～3μm間，針口小于1μm更佳，針尖開(kāi)口大于5μm易刺傷細胞。具體方法如下：
(1)注射用DNA制備(同前)。
(2)顯微注射針：取顯微注射針數個(gè)，鏡下挑選最佳者，高壓滅菌后，無(wú)菌吸入一定量的DNA，把注射針安裝在顯微針持針器上，調動(dòng)控制器旋扭，選擇注入DNA壓力參數。
(3)細胞：取一皿生長(cháng)狀態(tài)良好的細胞，置于顯微針臺上(能自控調溫)，敞開(kāi)皿蓋，調動(dòng)持針器把顯微針移入培養皿內。
(4)注射準備：調動(dòng)持針器旋扭，把針尖調至接近細胞(相差鏡下觀(guān)察)使針的長(cháng)軸與培養皿平面保持30°左右。超過(guò)45°注射時(shí)，針尖易折斷，小于30°時(shí)，針的柄部會(huì )受培養皿邊緣阻擋，靠在皿邊上能有助于限制注射針的活動(dòng)范圍。
(5)注射：選健康完整的細胞(或受精卵)，把注射針尖調至對準細胞質(zhì)邊緣（如接近中央或超過(guò)中央，注射時(shí)細胞易被針尖穿透），腳踏注射開(kāi)關(guān)，則一定量的DNA即被注射入細胞內，可立見(jiàn)細胞微微膨張。說(shuō)明DNA已被注入，如此反復注射至所需數量的細胞。
(6)培養：其培養、觀(guān)測、篩選等方法與其它轉染法相同
采用此法在大量細胞群中被注射的細胞僅為少數，由于注射損傷，需進(jìn)行修復，增殖變慢，因此，難以從中克隆出被轉染的細胞，因此采用neo基因共轉染和G418篩選法是可行的或采用標記刮除法也可。細胞顯微注射法除適于注射DNA片斷、寡核苷酸外，也可用于注射蛋白質(zhì)、抗體及各種對細胞有影響的藥物。
三、逆轉錄病毒載體介導DNA轉染
逆轉錄病毒載體屬RNA病毒，但可在受染細胞內反轉錄產(chǎn)生DNA互補鏈，此DNA單鏈可作為模板合成第二條DNA鏈，第二條DNA鏈可摻入細胞基因組DNA中。此病毒可利用宿主細胞的酶自行轉錄與復制，RNA可合成蛋白，再包裝病毒，RNA從胞內釋放，成為感染性病毒，該載體可經(jīng)不同方式改變。介導過(guò)程可使病毒單拷貝基因組穩定地進(jìn)入細胞。
首先，逆轉錄病毒的繁殖必須要有適當的包裝細胞系，以利于產(chǎn)生高滴度的病毒，同時(shí)還具有適當的結構。如：ψ2(第一代包裝細胞)，PA317(第二代包裝細胞)，ψ1-CRIP、PG13、DA、CFA(第三代包裝細胞)，包裝細胞可提供逆轉錄病毒gag、pol和env蛋白才能使帶有包裝信號及目的基因的病毒載體RNA進(jìn)行包裝，包裝細胞只提供gag、pol和env蛋白而不產(chǎn)生具有復制能力的野生型病毒(RCR)，而第一代包裝細胞可產(chǎn)生RCR，安全性較差；第二代包裝細胞，臨床上已廣泛應用，也未發(fā)現產(chǎn)生RCR，安全性好；第三代包裝細胞更加安全，第三代包裝細胞中主要區別是病毒結構基因中env不同。
反轉錄病毒作為基因轉移的載體有如下特點(diǎn)：①反轉錄病毒感染細胞的效率高，基因轉移率在10%-100%；②病毒基因轉移能將外源基因整合到宿主細胞基因組中外源基因能穩定存在而不丟失；③外源基因整合的拷貝數一般只有一個(gè)；④反轉錄病毒只選擇感染分裂細胞；⑤病毒可容納外源基因的DNA長(cháng)度為<8Kb。
反轉錄病毒載體的結構：已切除了病毒的結構基因gag，大部分pol和env，包括兩側的LTR，被選擇(標記)基因和目的基因插入的多聚位點(diǎn)所取代，同時(shí)還帶有包裝信號ψ。
(一)可產(chǎn)生特異性逆轉錄病毒細胞系的建立
1、逆轉錄病毒載體進(jìn)入包裝細胞系
從細胞質(zhì)粒中產(chǎn)生感染性病毒包括將質(zhì)粒導入包裝細胞系，可從穩定感染細胞中選擇病毒產(chǎn)生細胞或用一個(gè)包裝細胞系暫時(shí)產(chǎn)生的病毒感染另一種有不同包裝的細胞系，從中選擇病毒的產(chǎn)生細胞。
1.1準備工作（用品）：
(1)適當的包裝細胞系及培養液
(2)大多數包裝細胞系為鼠源的，含有鼠“Helpe病毒”，此病毒可幫助被去除某些功能結構基因的逆轉錄病毒復制，并包裝于蛋白衣殼中。
(3)逆轉錄病毒質(zhì)粒DNA常構建成含有抗藥基因neo新霉素基因的載體。
(4)Hepes-緩沖液(HeBs)
(5)2mol/L CaCL2
(6)含血清及不含血清培養液
(7)HeBs 15%甘油（HeBs/甘油）
(8)800mg/L(100×聚凝胺)(肝素對抗物)
(9)10%～15%DMSO
(10)10cm、6cm培養皿
(11)24孔、6孔培養板
(12)克隆環(huán)
1.2操作步驟：
(1)轉染前，10cm培養皿中接種大約10%～20%皿底面積的包裝細胞。
(2)將10μg含抗藥基因的逆轉錄病毒質(zhì)粒DNA加入0.5mL HeBs中，加入32μL 2mol/L CaCL2,輕振動(dòng)，加蓋30分鐘，室溫下培養45分鐘，直到小的、模糊的蘭色沉淀產(chǎn)生。
(3)從包裝細胞中棄去舊液，輕輕滴入HeBs-DNA沉淀于細胞培養皿中心，使細胞接觸DNA20分鐘，每10分鐘輕輕搖動(dòng)培養皿，使溶液均勻，加入10mL培養液，并于37℃放置4小時(shí)。
(4)完全吸出培養液，逐滴加入2.5mL的HeBs/甘油，放回培養箱繼續培養，如果使用的是ψ2/YCRE/YCRIP/PA317包裝細胞系，需培養3.5分鐘，若為Q2bn包裝細胞系，需培養1.5分鐘，或根據不同包裝細胞選用不同時(shí)間。迅速棄去HeBs/甘油，用10mL培養液洗2次，加入含有血清的5ml培養液培養18～24小時(shí)。
(5)取出培養液用0.45μm過(guò)濾，可獲得含有短期產(chǎn)生病毒的培養上清，-70℃或-80℃貯存，或立即用于其它包裝細胞系的感染。
(6)加入10ml培養液于上述已感染的細胞，繼續培養2～3天，繼續步驟10。
(7)另一包裝細胞受感染前1:10或1:20傳代。
(8)倒去包裝細胞的培養液，加入步驟5獲得的病毒。方法如下：
對于10cm培養皿，將0.1至1.0mL病毒貯存液稀釋至3～5mL的終體積，加入800mg/L聚凝胺至終濃度為8 mg/L，培養1小時(shí)以上。
(9)若10cm培養皿加入10mL培養液，6mL培養皿中應加入4mL培養液，培養2～3天。
(10)步驟6或步驟9得到的感染細胞，2～3天后按1:10或1:20傳代，接種于選擇培養液培養3天，更換培養液，繼續培養3～4天，直至克隆出現。
(11)用克隆環(huán)挑出分離的克隆，每個(gè)克隆接種24孔板或6孔板中的二個(gè)孔，生長(cháng)至50～90%底部面積。
(12)倒去培養液，換入1倍體積的培養液，繼續培養1～3天，收取培養液，馬上滴定，或者貯存于-70℃或-80℃。
(13)繼續傳代克隆細胞直到能被冷凍或被鑒定，若病毒產(chǎn)生克隆被鑒定，10%～15%DMSO保護劑液氮凍存細胞。即產(chǎn)生病毒細胞系建立。
2、病毒滴度鑒定
在分離產(chǎn)生病毒的克隆后，需進(jìn)行病毒滴度的測定，常用的方法是用病毒感染目的細胞，可根據載體RNA或蛋白的出現粗略定量分析。
2.1準備工作：
(1)病毒貯存液（步驟5所得）
(2)目的細胞系(NIH3T3成纖維細胞)
(3)G418或其它選擇性藥物
2.2操作步驟：
(1)目的細胞系NIH3T3細胞在感染前一天按1:10至1:20接種6cm培養皿。
(2)感染當日，棄去目的細胞培養舊液，加入含病毒的貯存液(步驟5所得)，用1～2ml含0.01～0.1病毒貯存液感染6cm培養皿目的細胞(或者3～5ml用于10cm培養皿中的細胞)，加入800 mg/L聚凝胺至終濃度為8 mg/L，培養1～3小時(shí)，37℃。
3)加入培養液，稀釋聚凝胺至2 mg/L，再繼續培養2～3個(gè)細胞周期(NIH3T3細胞周期為2～3天)。
(4)-a，如果病毒帶有組化標記基因，如LacZ,用X-gal染色感染細胞。按步驟6計算藍色克隆的數量以得到病毒的滴度。
(4)-b，如果病毒攜帶抗藥基因，傳代細胞應選擇培養條件。如果抗藥基因為neo，細胞按1:10至1:20傳代，接種含有G418的兩個(gè)10cm(或6cm)培養皿中，培養3天。
(5)更換培養液(含選擇性G418藥物)共培養7-10天，此時(shí)克隆應該非常明顯，計算克隆數。
(6)滴度計算公式：
G418-RCFU(集落形成單位)/m=克隆數/病毒體積(mL)×復制因子X(jué)接種率
若為(4)-a中所敘，病毒攜帶LacZ,用X-gal染色細胞根據顯示的克隆數，計算病毒的滴度，其公式為：
X-gal CFU/mL=X-gal陰性克隆數/病毒體積(mL)
(7)其它方法再鑒定產(chǎn)生病毒的克隆，細胞所產(chǎn)生的病毒基因無(wú)重新排列或缺失。
2.3 X-gal對感染細胞的染色方法（此方法可使該病毒感染細胞著(zhù)色，可用于直接測量病毒滴度）。
（1）準備工作
除以上各種實(shí)驗用品外，尚需：
①帶有LacZ編碼病毒的轉染(或感染)的細胞；
②固定液：0.05%戊二醛或2%多聚甲醛；
③X-gal染液。
（2）操作步驟
①倒去培養液，向感染細胞的皿中加入固定液(6cm皿加2mL，10cm皿加5mL)，加2%多聚甲醛室溫固定60分鐘，或0.05%戊二醛固定5～15分鐘。
②去除固定液，用PBS洗3次，第二次洗滌時(shí)放置10分鐘，首次和末次洗滌時(shí)則快速。
③加入最小體積的X-gal溶液，蓋住細胞37℃1小時(shí)或過(guò)夜，陽(yáng)性細胞（病毒感染細胞）則成蘭色。
(二)原代培養正常上皮細胞的逆轉錄病毒轉染
通過(guò)將病毒基因轉染到上皮細胞中，使細胞可在體外無(wú)限生長(cháng)，保持正常上皮細胞的特點(diǎn)。
1、準備工作：
(1)產(chǎn)生病毒的細胞系，方法見(jiàn)上。
(2)DMEM培養液 谷氨酰胺0.02μg/mL
胰島素0.25μg/mL
轉鐵蛋白0.12μg/mL
葡萄糖67.5μg/mL
10%小牛血清
聚凝胺1μg/mL
氫化考的松0.02μg/mL
(3)絲裂霉素C、胰酶、6cm培養皿
2、操作步驟：
(1)病毒產(chǎn)生細胞系暴露于絲裂霉素C(4 mg/L)2小時(shí)，洗干凈后，胰酶消化，按5×106接種6cm培養皿，培養液為DMEM。
(2)待轉染的原代培養正常上皮細胞接種于鋪有以上細胞的培養皿中，培養3天。
(3)更換培養液，繼續培養24小時(shí)。
(4)取50μL培養上清，進(jìn)行病毒滴度檢測，方法同前，9×103～7×104集落形成單位/mL可用于轉染。
(5)正常上皮原代培養10天后，取貼在飼養層細胞的上皮細胞，保留至上皮細胞數生長(cháng)量足夠選擇。
(6)在上皮細胞生長(cháng)2～4周內，成活的克隆用克隆環(huán)挑出，再繼續使用三輪有限稀釋法建立單個(gè)細胞系克隆。
3、鑒定：
按病毒所帶有的抗藥基因進(jìn)行選擇培養篩選，或其它方法鑒定轉染細胞，方法見(jiàn)后。
4、注意事項：
無(wú)論用什么方法將DNA導入細胞，暫時(shí)或穩定的轉染率很大程度取決于細胞的類(lèi)型。不同的細胞系對獲取外源性DNA以及表達的能力相差幾個(gè)數量級。此外，一種方法對一種培養細胞有效，但對另一種培養細胞可能無(wú)效。
四、轉染細胞鑒定
在轉染之前，外源性DNA載體，可設計含有抗藥性基因，再用選擇性培養液，篩選轉染細胞的方法已介紹，轉染后的受體細胞可能仍為正常細胞，但具備了一些其它生長(cháng)特點(diǎn)，而有的則可能發(fā)生轉化。
人腫瘤DNA轉入NIH3T3細胞后，細胞排列紊亂，核漿比例增大，可見(jiàn)核分裂相增多。
人正常上皮細胞經(jīng)SV40大T病毒轉染后，可建立細胞系，細胞呈無(wú)限生長(cháng)，但上皮細胞形態(tài)基本不變，光鏡、電鏡觀(guān)察可見(jiàn)轉染后的上皮細胞與轉染前上皮細胞結構相似。下面簡(jiǎn)述一般的鑒定方法：
1、被轉移DNA檢測
經(jīng)轉染的細胞提取基因組DNA，以適當限制性?xún)惹忻该盖泻?，進(jìn)行Sourthern轉移分析，檢測經(jīng)轉染細胞中是否存在被轉移的DNA序列。
若人腫瘤DNA轉染鼠NIH3T3細胞系，則可在轉化細胞中分析人Alu序列，動(dòng)物細胞中沒(méi)有人這種特有的Alu序列，NIH3T3細胞經(jīng)人腫瘤DNA轉染后，應帶有人的Alu序列。
若SV40大T病毒突變DNA轉染人正常上皮細胞則可在轉染細胞找到SV40病毒DNA。
此外，若用質(zhì)粒DNA轉染細胞，可在質(zhì)粒DNA上設計抗藥基因或可檢測的標記物基因。這樣，所得克隆可針對這些標記物進(jìn)行鑒定，如neo基因和LacZ基因，鑒定方法同前。
2、免疫組織化學(xué)染色
選擇一些特異性抗體鑒定特定的細胞，如正常原代培養上皮經(jīng)轉染后，可用結合上皮細胞的抗體或角蛋白來(lái)證實(shí)轉染細胞為上皮細胞，同時(shí)也可用波形絲蛋白抗體，上皮細胞應為陰性。
3、軟瓊脂培養
可用于區別正常細胞和轉化細胞。
3.1用品：
0.9%瓊脂糖 1.5%瓊脂糖
DMEM20黃 5%谷氨酰胺
DMEM12黃
3.2步驟：
(1)將培養液預熱至37℃
(2)將1.5%瓊脂糖加熱煮沸溶熔化滅菌，冷卻至40℃，保溫。
(3)取1份1.5%瓊脂糖，2份培養液 20黃 5%谷氨酰胺混合。
(4)取3mL以上液體，鋪6cm培養皿中，并冷卻形成膠狀。
(5)將0.9%瓊脂糖加熱煮沸，冷卻至40℃。
(6)取1份0.9%瓊脂；2份DMEM 12黃，4×105待測細胞(溫度不超過(guò)40℃)混勻。
(7)取1.5mL以上溶液，加入已預先鋪好的瓊脂糖的培養皿上。
(8)37℃ CO2培養。
3.3結果分析：
若是轉化細胞，則可見(jiàn)軟瓊脂中形成克隆，若為正常上皮細胞，則不形成克隆。
4、轉染細胞的致瘤性檢測
取2×106轉染細胞，懸混于0.1mL PBS中，在無(wú)菌條件下接種于4周齡雄性裸鼠背部，每種細胞至少接種8個(gè)位點(diǎn)，待其生長(cháng)6個(gè)月，若為轉染細胞已發(fā)生轉化，則可在裸鼠身上形成腫瘤。若仍為正常上皮細胞，則無(wú)腫瘤形成。以此方法可區分正常細胞與轉化細胞。
（本文轉載：丁香通）
