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動(dòng)物細胞轉染技術(shù)三

動(dòng)物細胞轉染技術(shù)三

      1.將HeLa細胞2×105個(gè)接種于35mm培養皿中,培養基為10%FBS的DMEM,37℃,5%CO2培養箱條件培養。
      2.對GFP質(zhì)粒進(jìn)行除菌處理和濃度測定,可采用無(wú)水乙醇沉淀GFP質(zhì)粒,再用70%的乙醇洗1或2次,將沉淀的質(zhì)粒溶于滅菌的TE中,然后用紫外粉光關(guān)都系測出質(zhì)粒的準確濃度,質(zhì)粒的濃度(μg/ml)=OD260值×50μg/ml×稀釋倍數。
      3.當細胞融合約為80%時(shí),開(kāi)始進(jìn)行轉染處理。在一個(gè)1.5ml的EP管中,加入100μl無(wú)血清DMEM培養基,取2ugGFP質(zhì)粒DNA溶解其中;在另一個(gè)1.5mlEP管中,加入100ul無(wú)血清DMEM培養基,取6-8ul脂質(zhì)體轉染劑稀釋于其中,再將兩管溶液混合均勻,室溫下放置20min。
      4.用2ml無(wú)血清DMEM培養基漂洗細胞2遍,向質(zhì)粒DNA與脂質(zhì)體轉染劑的混合液加入0.8ml無(wú)血清DMEM培養基并混勻,然后加到漂洗過(guò)的細胞上。
      5.將細胞放入培養箱培養3-8h,然后加入1ml含20%FBS的DMEM培養基繼續培養。
      6.培養24h后,將培養基吸出,加入2ml含10%FBS的DMEM培養基,37℃,5%CO2培養箱培養。
      7.在熒光顯微鏡下實(shí)時(shí)觀(guān)察細胞,表達GFP的細胞在藍光激發(fā)下可呈現綠色熒光。


注意事項:
      1.注意細胞的生長(cháng)狀態(tài),最適合轉染的細胞是達到指數生長(cháng)期生長(cháng)旺盛的細胞。
      2.實(shí)驗前進(jìn)行預試驗確定適當的接種量和培養時(shí)間。
      3.DNA若不純,會(huì )嚴重影響轉染效率。
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