流式細胞實(shí)驗總結：內容包括流式細胞儀流程、原理、各種類(lèi)型的樣本操作、樣本準備，以同型對照的理解，及不同情況下如何使用封閉劑等。

流式細胞儀(FCM)是八十年代集單克隆抗體、熒光化學(xué)、激光、計算機等高技術(shù)發(fā)展起來(lái)的一種先進(jìn)儀器，已廣泛應用于免疫學(xué)、生物化學(xué)、生物學(xué)、腫瘤學(xué)以及血液學(xué)等方面的研究和臨床常規工作。其中檢測人白細胞表面標志可對白血病、淋巴瘤作用迅速正確的診斷，對淋巴細胞群和亞群進(jìn)行精確分類(lèi)，還能分離純化某一群或亞群細胞?；罴毎庖邿晒饧夹g(shù)是用于FCM檢測的標本準備，染色后也能在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察，在某些實(shí)驗條件下，活細胞免疫熒光染色后的特異性和敏感性要優(yōu)于滴片固定的常規間接免疫熒光的結果。

(一)　原理

活細胞表面保留有較完整的抗原或受體，先用特異性鼠源性單克隆抗體與細胞表面相應抗原結合，再用熒光標記的第二抗體結合，根據所測定的熒光強度和陽(yáng)性百分率即可知相應抗原的密度和分布。

(二)　操作步驟

制備活性高的細胞懸液(培養細胞系、外周血單個(gè)核細胞、胸腺細胞、脾細胞等均可用于本法)。

用10%FCS RPMI1640調整細胞濃度為5×106～1×107/ml，取40μl細胞懸液加入預先有特異性McAb(5～50μl)的小玻璃管或塑料離心管，再加50μl 1∶20(用DPBS稀釋)滅活正常兔血清，4℃ 30min，用洗滌液洗滌2次，每次加洗滌液2ml左右，1000rpm×5min，棄上清，加入50μl工作濃度的羊抗鼠(或兔抗鼠)熒光標記物，充分振搖，4℃ 30min，用洗滌液洗滌2次，每次加液2ml左右，1000rpm×5min，加適量固定液(如為FCM制備標本，一般加入1ml固定液，如制片后在熒光顯微鏡下觀(guān)察，視細胞濃度加入100～500μl固定液)，FCM檢測或制片后熒光顯微鏡下觀(guān)察(標本在試管中可保存5～7天)

(三)　試劑和器材

1.各種特異性單克隆抗體。

2.熒光標記的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗體，滅活正常兔血清。

3.10% FCS RPMI1640, DPBS、洗滌液、固定液(見(jiàn)附錄)。

4.玻璃管、塑料管、離心機、熒光顯微鏡等。

(四)　注意事項

1.整個(gè)操作在4℃下進(jìn)行，洗滌液中加有比常規防腐劑量高10倍的NaN3，上述實(shí)驗條件是防止一抗結合細胞膜抗原后發(fā)生交聯(lián)、脫落。

2.洗滌要充分，以避免游離抗體封閉二抗與細胞膜上一抗相結合，出現假陰性。

3.加適量正常兔血清可封閉某些細胞表面免疫球蛋白Fc受體，降低和防止非特異性染色。

4.細胞活性要好，否則易發(fā)生非特異性熒光染色。

?附：

1. DPBS 

(×10, 貯存液)NaCl 80g  KCl 2g 　蒸餾水加至1000ml  Na2HPO4 11.5g 臨用時(shí)用蒸餾水1∶10稀釋 KH2PO4 2g

2.洗滌液

DPBS　900ml  FCS 50ml (終濃度　5%)  4%NaN3 50ml (終濃度0.2%)

3.固定液

DPBS　1000ml  葡萄糖　20g (終濃度2%)  甲醛　10ml  NaN3　0.2g (終濃度0.02%)

(一)不同來(lái)源樣品的處理

1. 培養細胞

(1)培養細胞用0.25%的胰酶消化。

(2)PBS或生理鹽水洗滌細胞2次，再用PBS或生理鹽水懸浮細胞，加入預冷的無(wú)水乙醇，終濃度為60%～70% ，快速混勻，并用封口膜封口，置4℃下可保存15天左右。

2. 新鮮標本

(1)將標本切成1～2mm3的小塊。

(2)PBS或生理鹽水清洗后去除上清，加入0.2%膠原酶(或0.15%胰蛋白酶)37℃消化10～30min(根據實(shí)驗及不同組織確定)，并不斷振動(dòng)。

(3)300目尼龍篩過(guò)濾，除去組織團塊，PBS洗滌2次，300g離心5min，獲得已消化的細胞。

3. 石蠟包埋標本

(1)標本在切片機上切取3～5片50μm厚的組織片。

(2)將切片徹底脫蠟，梯度乙醇(100%、95%、70%)及蒸餾水水化。

(3)0.5%胃蛋白酶(或胰蛋白酶)37℃消化30min，每隔10min振動(dòng)1次。

(4)300目尼龍篩過(guò)濾，獲得的細胞懸液PBS洗滌2次，300g離心5min。

注意：脫蠟一定要完全(若加入100%乙醇無(wú)絮狀物飄起即可);切片厚薄適宜，太薄碎片多，影響FCM分析結果，太厚易造成脫蠟不凈;注意掌握消化時(shí)間，避免已釋放的細胞被消化。

(二)直接免疫熒光標記的樣品制備

用標有熒光素的特異抗體對細胞進(jìn)行直接染色，然后用流式細胞儀檢測，陽(yáng)性者即表示有相應抗原存在。實(shí)驗步驟如下：

1. 每份取100μl單細胞懸液(細胞密度約1×106個(gè)細胞)。

2. 一份加入相應量的FITC或PE標記的特異性熒光直標單抗，另一份加入熒光標記的無(wú)關(guān)單抗，作為同型對照樣品。

3. 室溫下避光反應一定時(shí)間(時(shí)間長(cháng)短根據試劑說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行)，一般在室溫下反應15～30min即可。

4. 加入500μl PBS重懸成單細胞懸液即可上機檢測。

(三)間接免疫熒光標記的樣品制備

1. 取1×106個(gè)細胞/100μl，先加入一抗混勻，置室溫下避光反應30min。

2. 用PBS洗滌細胞2次，離心沉淀棄掉上清液(離心轉數一般為800～1000rpm，5min)。

3.用100μl PBS重懸細胞，再加入FITC或PE標記熒光二抗(用量均按說(shuō)明書(shū)要求加入)混勻，室溫下反應30min。

4. 用PBS再洗滌細胞2次，加入500μl PBS重懸成單細胞懸液，上機檢測。

注意：以上兩種染色方法的抗體加入量和反應時(shí)間，一般根據試劑使用說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行。若說(shuō)明書(shū)上未說(shuō)明，應先進(jìn)行預實(shí)驗，掌握好劑量與最佳反應時(shí)間后，再進(jìn)行流式樣品的制備。制備好的樣品，若不能及時(shí)上機檢測，用1%～4%的多聚甲醛固定，4℃下可保存5天。

(四)DNA熒光染色的樣品制備

DNA是細胞內含量比較恒定的參量，隨著(zhù)細胞增殖周期的各時(shí)相而發(fā)生變化。熒光染料(如PI)可選擇性地定量嵌入核酸(DNA/RNA)的雙螺旋堿基之間，與細胞特異性結合，DNA含量與熒光染料的結合量成正比，因此通過(guò)測定熒光強度可獲知細胞的增殖情況。

1. 將固定過(guò)的細胞離心(500～1000rpm，5min)棄上清液，再用PBS洗滌2次。

2. 用PBS調整細胞濃度，每份為1×106個(gè)細胞/100μl。

3. 加入1000μl DNA 熒光染料(通常用Coulter公司提供的DNA染色試劑盒)，室溫下避光染色15 min。

4. 上流式細胞儀檢測。

以上樣品的制備可分析細胞周期各時(shí)相的百分比，同時(shí)可粗略觀(guān)察有無(wú)凋亡細胞現象，如果用對照液(雞紅細胞)作參照標準，可進(jìn)行細胞DNA倍體分析，通過(guò)DNA指數(DNA index，DI)衡量DNA的相對含量，DI可用下式計算：DI=樣品G0/G1期的均值/正常二倍體細胞G0/G1期均值

(五)細胞凋亡檢測樣品的制備

根據實(shí)驗方案誘導細胞凋亡，制備單細胞懸液，使用 Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒，通過(guò)Annexin V抗體與磷脂絲氨酸(PS)的特異性結合來(lái)檢測細胞凋亡的情況。

1. 將10×的結合緩沖液用蒸餾水稀釋成為1×，冰育。

2. 懸浮細胞在低溫環(huán)境中，用PBS洗滌細胞2次(800～1000rpm離心，5min)。

3. 棄上清，加入490μl預冷的結合緩沖液重懸細胞(細胞濃度為105～106/ml)。

4. 加入5μl Annexin V-FITC和5μl PI于細胞懸浮液中，輕輕混勻。

5. 將試管置于冰上，避光孵育10分鐘。

6. 上FCM檢測。

(六)微量全血法免疫熒光標記的樣品制備

目前制備全血細胞樣品的方法很多，且很成熟，常用的方法是用淋巴細胞分離液分離淋巴細胞，然后進(jìn)行特異性熒光染色，其染色方法與前面介紹的方法相同。下面主要介紹與流式細胞儀配套的Q-PREP(免疫學(xué)樣品處理器)進(jìn)行快速制備微量全血樣品的方法。

1. 微量全血直接熒光染色法

(1)取肝素或EDTA抗凝全血(100μl/份)，置12×75mm專(zhuān)用塑料試管中。

(2)每份加入20μl特異性熒光單抗，另一份加入熒光標記的無(wú)關(guān)單抗作同型對照，室溫下避光染色15min。

(3)置 Q-PREP 儀上溶解紅細胞、穩定和固定白細胞，靜置5min。

(4)上流式細胞儀檢測。

2. 微量全血間接熒光染色法

(1)取肝素或EDTA抗凝全血(100μl/份)，置12×75mm專(zhuān)用塑料試管中。

(2)加入50μl特異的單克隆抗體(一抗)，室溫下孵育30min。

(3)置Q-PREP儀上溶解紅細胞，穩定和固定白細胞。

(4)離心(800～1000rpm，5min)棄上清液，用PBS洗滌細胞2次。

(5)加入50μl熒光(FITC或PE)標記的第二抗體，室溫下避光染色30min。

(6)上流式細胞儀檢測。

3. 注意事項

(1)新鮮全血一般室溫下放置8小時(shí)以?xún)瓤梢允褂?，時(shí)間過(guò)長(cháng)會(huì )使活性降低，影響測定結果。

(2)抗凝血應保證無(wú)血塊凝集。

(3)全血加入試管中時(shí)，應盡量避免加到試管壁上，如沾到了管壁上必須用用棉簽擦凈，否則會(huì )影響細胞二維點(diǎn)圖的細胞群的分離效果。

(七)樣品制備應注意的問(wèn)題和影響因素

1. 樣品制備應注意的問(wèn)題

(1)單細胞懸液的制備是流式細胞術(shù)分析的關(guān)鍵。如遇有細胞團塊應先用300～500目的細胞篩網(wǎng)過(guò)濾后，再上機檢測。

(2)標本采集后要及時(shí)固定或深低溫保存，手術(shù)切除的新鮮標本或活檢針吸標本取材時(shí)，要避免出血與壞死組織。

(3)免疫熒光標本應注意死細胞和碎片的去除，要求每份樣品中雜質(zhì)、碎片、團塊重疊細胞應<2%，尤其是稀少細胞或細胞亞群的測定時(shí)，否則這些細胞的非特異性熒光增加，會(huì )干擾免疫熒光測定。

(4)細胞樣品的采集要保證足夠的細胞濃度，一般每份樣品要求的細胞數為5×105/ml～1×106/ml，對腫瘤細胞DNA異倍體的樣品分析，至少應有20%的腫瘤細胞存在(占主峰1/5以上的異倍體才可確認為異倍體峰)。

(5)石蠟包埋組織單細胞制備時(shí)要注意：選取含待測細胞豐富的區域;石蠟組織片的厚度要適宜，最好為40～50μm;徹底脫蠟，以免殘留的石蠟影響酶的消化活性;充分水化，使組織還原到與新鮮組織相似的狀態(tài)。

2. 影響樣品制備的因素

(1)溫度對熒光強度的影響：一般認為，溫度升高時(shí)熒光減弱，所以在熒光測量時(shí)要保持染色后的樣品在適當低溫環(huán)境下進(jìn)行，并盡可能減少樣品的光照射時(shí)間。有條件時(shí)，應使樣品觀(guān)察室做到恒溫裝備，使溫度對熒光染色的影響減少到最小，會(huì )得到更好的熒光定量測定的結果。

(2)pH值對熒光強度的影響：每一種熒光染料分子發(fā)光的最高量子產(chǎn)額，都有自己最適合的pH值，以保持熒光燃料分子與溶劑間的電離平衡，如果pH值發(fā)生改變，可能造成熒光光譜的改變，如FITC在酸性溶劑中呈藍色熒光，為陽(yáng)離子發(fā)光;在堿性溶劑中呈黃綠色熒光，為陰離子發(fā)光。

同型對照

1、同型對照不是萬(wàn)能的。同型對照雖然與試驗抗體是同種型，而且具有相同的熒光標記，但不一定是同一廠(chǎng)家生產(chǎn)的，肯定不是同一批次的，也很難保證每個(gè)抗體上標記的熒光分子的數目是相同的，所以很多情況下發(fā)現用同型對照調的參數并不合適。

2、是否需要同型對照取決于要檢測的指標。

(1)對于一些細胞特異性的亞群標志，比如CD3/4/8這些，對于某一細胞來(lái)說(shuō)它或者表達，或者不表達，這時(shí)只要抗體和標記技術(shù)沒(méi)問(wèn)題都會(huì )清晰分群，無(wú)需同型對照，甚至不需要陰性對照。

(2)某些分子在細胞上原本不表達，或表達極低，加入處理因素后表達明顯上調，這種通常也能明顯分群，也不需要同型對照，但要有未加處理因素的陰性對照。檢測細胞表面活化分子的表達，細胞內因子檢測等通常是這種情況。

(3)如果細胞群中大部分細胞都表達要檢測的目標分子，只是有的表達高些，有的表達低些，通常細胞不能明顯分群。此時(shí)通常需要以同型對照做參考，雖然它也不一定百分之百正確。

IgG-FITC同型(IgG1 or IgG2a or IgG2b, etc.)

封閉情況

對于表面分子，可以不設同型對照，對于細胞內細胞因子，應設同型對照，有利于對照陽(yáng)性染色是否成功，以及分析時(shí)設定gate。如果是mice cell, 實(shí)在不設也可以，目前為止，我看Isotype似乎都沒(méi)反應。

如果嚴謹的做流式,都是應該做同型對照的,據我們自已做的經(jīng)驗,特別是以下幾種情況最好是做同型對照:

1、自已標記的抗體:許多做單抗實(shí)驗室自已標記抗體的(國內許多數一數二的抗體實(shí)驗室在內),但這種自已標記的抗體,我們做同型對照經(jīng)常會(huì )與不做同型有很大的區別

2、一些表達比較低的分子:有些表達比較低的分子,特別是表面分子,做同型后的結果甚至會(huì )出現陽(yáng)性與陰性之間的明顯差異,這種事我們也經(jīng)歷過(guò)多次了.

熒光標記一抗的同型對照抗體只是缺了決定特異結合的Fc段。非熒光標記一抗的同型對照更簡(jiǎn)單，就是熒光二抗。

封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過(guò)程?？乖蚩贵w包被時(shí)所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據的空隙，封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。封閉的手續與包被相類(lèi)似。最常用的封閉劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明膠作為封閉劑的。脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其最大的特點(diǎn)是價(jià)廉，可以高濃度使用(5%)。高質(zhì)量的速溶食用低脂奶粉即可直接當作封閉劑使用，但由于奶粉的成份復雜，而且封閉后的載體不易長(cháng)期保存，因此在試劑盒的制備中較少應用。

脫脂牛奶，BSA，或者FCS，在ELISA及WB中用它們主要有兩個(gè)原因：

一是它們做為隋性蛋白，用來(lái)封閉酶標板或膜上的蛋白結合位點(diǎn)，使其后的蛋白不會(huì )因為非特異結合而影響本底(即所謂封閉);

二是在抗體等蛋白稀釋到很低濃度時(shí)會(huì )不穩定，它們可以起到保護，或穩定的作用，基本上可以理解為競爭關(guān)系。

封閉是沒(méi)有特異性的，所有的抗原表位都被結合了。

但非特異性結合容易被競爭替換，而特異性結合很難被競爭替換。

所以封閉主要是針對一抗的，沒(méi)有對二抗封閉的。