錯誤1：一小管原代細胞在水浴中解凍一段時(shí)間

糾正1：原代細胞對解凍過(guò)程非常敏感，因此將小瓶置于37℃水浴中，保持并輕輕旋轉直到內容物剛剛解凍是很重要的。然后應立即從水浴中取出小瓶，并轉移到無(wú)菌操作臺。確保您的培養瓶在解凍前已經(jīng)準備就緒，以便可以立即用于接種細胞，并置于培養箱中。

錯誤2：解凍match小瓶后直接離心原代細胞

糾正2：我們不建議在解凍后離心細胞，因為離心程序比少量的DMSO殘留更有害。記住，在恢復原代細胞后的第二天更換培養基以去除任何殘留的DMSO。

錯誤3：允許原代細胞變得過(guò)于融合

糾正3：當生長(cháng)至100％匯合時(shí)，原代細胞可以變得衰老。記住，原代細胞不是100％純，因此重要的是盡量減少污染細胞的生長(cháng)。我們建議在細胞達到90-95％融合時(shí)，對原代細胞進(jìn)行傳代培養。

錯誤4：傳代原代細胞時(shí)過(guò)度胰蛋白酶消化

糾正4：當細胞傳代時(shí)，使用低濃度的胰蛋白酶并在顯微鏡下密切監測細胞。此外，記得在胰蛋白酶消化后完全中和細胞中的胰酶，因為任何活性的胰蛋白酶都將損傷細胞。

錯誤5：原代細胞可以很容易地重新凍存

糾正5：通常我們不推薦重新凍存原代細胞，因為這可以促進(jìn)細胞衰老和/或導致功能變化。原代細胞非常敏感，重新凍結可能導致細胞死亡或損傷。

錯誤6：原代細胞可以無(wú)限的增殖

糾正6：與細胞系不同，原代細胞具有有限的擴增能力。我們建議盡早使用原代細胞進(jìn)行實(shí)驗以防止遺傳漂移。此外，如果你正在使用一個(gè)增值困難的細胞類(lèi)型，你應該密切監測細胞形態(tài)，因為少量混雜的細胞（如成纖維細胞）可能隨著(zhù)時(shí)間的推移，大量生長(cháng)從而成為主要細胞。

錯誤糾正后就該步入正軌啦——

應如何進(jìn)行凍存細胞的培養？

下列步驟以單管凍存細胞進(jìn)行培養的實(shí)驗方案為例。

● 準備一燒杯37°C的水。

● 從液氮儲存中取出一管細胞，注意保護手和眼睛。

● 擰松管蓋1/4圈，等待10秒鐘以釋放螺紋中可能殘留的液氮，再重新擰緊管蓋。

● 將凍存管的下半部分置于37°C水浴中進(jìn)行解凍，直至凍存管內僅剩余一小塊冰芯，使細胞迅速解凍。

● 用消毒液擦拭管體外表面，再將其移至II級A型層流細胞培養通風(fēng)櫥中。

● 打開(kāi)管蓋，使用1 mL移液器上下吹打細胞懸液以分散細胞。

臺盼藍染色（中洪博元實(shí)拍圖）

● 從管中吸取20 uL細胞懸液，并將其稀釋于20 uL臺盼藍溶液中（如：Gibco?臺盼藍，貨號 15250-061）。

● 使用血細胞計數板來(lái)確定每毫升懸液中的活細胞數。

● 將管中懸液（1 mL）稀釋至產(chǎn)品說(shuō)明中的推薦濃度（例如1.25 x 10E4活細胞/毫升，Gibco? 新生人表皮角質(zhì)形成細胞）。

● 將5 mL細胞懸液加入25 cm2培養瓶，或將15 mL細胞懸浮液加入75cm2培養瓶中。

● 搖勻培養瓶中的培養基以徹底分散細胞。許多類(lèi)型的細胞都會(huì )迅速貼壁，如果沒(méi)有在傳代后即刻搖勻細胞，細胞可能生長(cháng)不均勻。

● 在37°C、5% CO2/95%空氣、濕度細胞培養箱中培養細胞。為了獲得最佳結果，培養開(kāi)始后至少在24小時(shí)之內不要擾動(dòng)細胞。

是否可以對擴增后的細胞重新凍存？如果可以該如何操作？

當從Thermo Fisher Scientific購買(mǎi)了Gibco?或Invitrogen?凍存或正處于增殖期的細胞，可對其進(jìn)行擴增和重新凍存。不過(guò)，凍存操作可能會(huì )對細胞的生長(cháng)狀態(tài)有所影響。下列實(shí)驗方案為大家提供了一份使用Synth-a-Freeze?培養基凍存細胞的基礎指南，Synth-a-Freeze?培養基是Thermo Fisher Scientific旗下的一款成分確定，無(wú)蛋白成份的凍存培養基。

請注意：由于凍存設備與個(gè)人技術(shù)之間的差異，我們無(wú)法確保使用本方案凍存的細胞在復蘇后能夠保持活力，我們也無(wú)法為研究用戶(hù)實(shí)驗室凍存細胞的效果進(jìn)行擔保。

● 使用37°C水浴化凍Synth-a-Freeze?培養基或4°C條件下過(guò)夜化凍。

● 如果在水浴中進(jìn)行化凍，請確保溫度不要超過(guò)37°C，也勿將該產(chǎn)品延長(cháng)時(shí)間置于37°C。

● Synth-a-Freeze?培養基在使用前應置于4°C條件下徹底平衡。為獲得最優(yōu)結果，推薦大家使用能夠控制變溫速率的冰箱。如果缺少能夠控制變溫速率的冰箱，也可使用細胞凍存盒（如Thermo Scientific? Mr Frosty? container)。

● 如需用酶試劑解離培養器皿表面的細胞，則需使用對應的終止溶液重懸細胞以中和酶的效果。

● 通過(guò)離心沉淀細胞。

● 去除上清液后，使用預冷的Synth-a-Freeze?培養基以5x10E5至3x10E6細胞/毫升的密度重懸細胞。

● 將細胞懸液分裝至合適數量的凍存管中。

● 將細胞盡快冷卻至4°C。

● 如果使用控制變溫速率的冰箱：以每分鐘降低1°C的速率冰凍樣品，直至–40°C。之后按照每分鐘降低2°C的速率降至–90°C左右。

● 如果使用細胞凍存盒：請按照說(shuō)明書(shū)來(lái)準備凍存盒。

● 為獲得最佳結果，推薦大家在細胞溫度降至–80°C后，盡快將凍存管轉移至液氮儲存設備的氣相中。

● 作為Synth-a-Freeze?培養基的替代品，可使用該凍存細胞推薦的基礎培養基，添加10%胎牛血清（FBS）和10% DMSO進(jìn)行細胞凍存。請注意不推薦將Synth-a-Freeze?培養基用于人表皮黑素細胞的凍存操作。

中洪實(shí)驗室溫馨提醒：

組織塊貼壁法分離細胞時(shí)：注意組織塊貼壁2-3h后，補液時(shí)沿壁輕輕加入培養基，防止組織塊漂浮。