細胞為何要傳代： 細胞在培養過(guò)程中不斷的繁殖，數量也隨之增加，然而培養皿/培養瓶的空間有限，細胞增殖受到抑制，所以必須將一部分細胞移至別的培養皿/培養瓶，讓細胞有足夠生長(cháng)空間。

細胞傳代分兩種： 懸浮細胞傳代和貼壁細胞傳代

1、懸浮細胞傳代

由于細胞已經(jīng)在生長(cháng)培養基中懸浮，所以無(wú)需酶的作用使其從培養容器表面脫離，方法簡(jiǎn)單。通常有兩種方法。

材料準備：

1、裝有懸浮細胞的培養容器。

2、完全生長(cháng)培養基，預熱至37℃

3、37℃培養箱，充有二氧化碳濃度為5%的濕化空氣。

傳代流程：

一、直接傳代法

①待懸浮細胞長(cháng)滿(mǎn)至80%~90%（細胞懸液變黃），即可傳代；

②用吸管吸棄細胞懸液1/2~1/3；

③加入適量的新鮮培養基，繼續培養。

二、離心傳代法

①將細胞懸液轉移到離心管內；

②150g離心5min，棄去上層清液；

③使用新鮮的培養基重懸細胞；

④吸管吸取適量細胞懸液，裝入新的培養瓶，再加入適量的新鮮培養基，繼續培養。

2、貼壁細胞傳代

貼壁細胞需要用到一種特定的試劑——蛋白酶，其作用是切斷細胞和容器之間，細胞與細胞之間的相互粘連，用蛋白酶處理細胞的過(guò)程叫做“消化”，“消化”之后的下?lián)軙?huì )形成單細胞并從容器底部掉下來(lái)。最常用的蛋白酶是胰蛋白酶。

材料準備：

1、預熱培養用液：把已經(jīng)配制好的裝有培養液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內預熱；

2、用75%酒精擦拭經(jīng)過(guò)紫外線(xiàn)照射的超凈工作臺和雙手；

3、正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且減少污染；

4、點(diǎn)燃酒精燈：注意火焰不能太小。

傳代流程：

1. 取出預熱好的培養用液：取出已經(jīng)預熱好的培養用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺內。

2. 從培養箱內取出細胞：注意培養瓶取出細胞時(shí)要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺面，再在鏡下觀(guān)察細胞。

3. 將培養瓶放入超凈工作臺后打開(kāi)瓶口，同時(shí)要在酒精燈上燒口消毒。

4. 加入消化液：小心吸出舊培養液，用PBS清洗（沖洗），加入適量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以蓋住細胞最好，最佳消化溫度是37℃。

5. 顯微鏡下觀(guān)察細胞：倒置顯微鏡下觀(guān)察消化細胞，若胞質(zhì)回縮，細胞之間不再連接成片，表明此時(shí)細胞消化適度。 

6. 棄去胰蛋白酶液，加入新鮮的培養液終止反應。小心吹打成細胞懸液。

7. 將細胞懸液吸入10 ml離心管中。平衡后將離心管放入離心機中，以1000 rpm/min離心5 min。 

8. 棄去上清液，加入適當體積的培養液，用滴管輕輕吹打細胞制成細胞懸液。

9. 將細胞懸液吸出分裝至2-3個(gè)培養瓶中，加入適量培養基旋緊瓶蓋。

10. 顯微鏡下觀(guān)察細胞：倒置顯微鏡下觀(guān)察細胞量，必要時(shí)計數。注意密度過(guò)小會(huì )影響傳代細胞的生長(cháng)，傳代細胞的密度應該不低于5×105/ml。最后要做好標記。 

11. 繼續培養：用酒精棉球擦拭培養瓶，適當旋松瓶蓋，放入CO2培養箱中繼續培養。傳代細胞2-4 h后開(kāi)始貼附在瓶壁上。

3、注意事項

1、嚴格的無(wú)菌操作。

2、貼壁細胞消化適度：消化的時(shí)間受消化液的種類(lèi)、配制時(shí)間、加入培養瓶中的量等諸多因素的影響，消化過(guò)程中應該注意培養細胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。

3、傳代細胞所有的操作盡量靠近酒精燈火焰。每次最好只進(jìn)行一種細胞的操作，每種細胞使用一套器材。避免交叉感染。

4、傳代細胞瓶口每次打開(kāi)或者關(guān)閉都需要在酒精燈上消毒。

4、常見(jiàn)問(wèn)題

一、發(fā)現細胞有污染跡象，應該怎么辦？

一旦發(fā)現細胞有污染跡象，應立即采取措施，一般應棄置污染的細胞。如果必須挽救，可加含抗生素的BBS或培養基反復清洗，隨后培養基中加入大量的抗生素，并經(jīng)常更換培養基。

二、需要多久更換一次培養基？

一般2~3天更換一次培養基，這取決于細胞生長(cháng)速度。

三、可不可以使用于原先培養條件不同的培養基？

不能，每一細胞株均有其特定使用且已適應的細胞培養基，若換了一種培養基，細胞大多不適應，造成細胞無(wú)法存活。

四、可不可以使用與原先培養條件不同的胎牛血清種類(lèi)？

不能，胎牛血清是細胞培養上一個(gè)極為重要的營(yíng)養來(lái)源，所以胎牛血清的種類(lèi)和品質(zhì)對于細胞的生長(cháng)會(huì )產(chǎn)生極大的影響。來(lái)自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或者內容物上都會(huì )有所不同，胎牛血清使用錯誤也會(huì )造成細胞無(wú)法存活。

五、為什么我的細胞總是出現污染？

細胞培養需要嚴格的無(wú)菌環(huán)境，首先檢查培養基是否有問(wèn)題，再檢查實(shí)驗操作過(guò)程是否有問(wèn)題。尤其注意是否吸取液體過(guò)快或者操作時(shí)手從皿的上方經(jīng)過(guò)造成了污染。