Annexin V & 7 氨基放線(xiàn)菌素（7-amino-actinomycin D, 7-AAD）或碘化丙啶（Propidium iodide, PI）雙染法檢測細胞凋亡原理。

正常細胞（活細胞）具有完好的細胞膜，此時(shí)細胞膜的組分之一——磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine，PS）位于細胞膜的內側，當細胞發(fā)生凋亡時(shí)，細胞膜的結構發(fā)生改變，這使得原本在細胞膜內側的PS外翻到細胞膜的表面，這種現象在凋亡的早期就會(huì )出現，因此就可以用與PS具有高親和力、標記了熒光素的膜連蛋白V（Annexin V）來(lái)檢測早期凋亡的細胞。

由于晚期凋亡和一些壞死的細胞也可以與Annexin V結合，因此需要引入另一種指標來(lái)將早期凋亡的細胞與之區分，這種指標就是細胞膜的通透性。與正常細胞和早期凋亡細胞不同，晚期凋亡及壞死細胞的膜通透性會(huì )增加，因此，一些原本不能進(jìn)入到正常細胞內的核酸染料（如7-AAD和PI）便有機會(huì )進(jìn)入細胞內與DNA結合。

所以，通過(guò)Annexin V和7-AAD /PI雙染的方法，就可以把早期凋亡的細胞與晚期凋亡加壞死的細胞區分開(kāi)來(lái)。

Annexin V和7-AAD雙標測凋亡流式染色實(shí)例

小鼠腹腔巨噬細胞（每樣2-5×105個(gè)細胞）Annexin V和7-AAD雙染實(shí)例（本實(shí)例中巨噬細胞凋亡是通過(guò)紫外線(xiàn)30分鐘照射誘導的）

1. 標志物：

活細胞：Annexin V-7-AAD-；早期凋亡細胞：Annexin V+7-AAD-；晚期凋亡和壞死細胞：Annexin V+7-AAD+；某種特定壞死細胞：Annexin V-7-AAD+；

2. 流式細胞儀：BD FACSCalibur；

3. 流式抗體及用量：1×Binding Buffer（250ul/test，聯(lián)科生物的5×Binding Buffer用ddH2O配制，貨號：LK-AP101-100-BB）；Annexin V-APC（1ul/test，貨號：BMS306APC，eBioscience）；7-AAD（5ul/test; 貨號：559925，BD）；

4. 染色條件：本實(shí)例用胰酶將細胞消化下來(lái)進(jìn)行染色，并沒(méi)有染細胞的表面分子，如需標記表面分子，切記勿用胰酶，請在染Annexin V和7-AAD之前先按常規染法標記表面分子，洗去多余抗體后即可用1×Binding Buffer重懸細胞，加入Annexin V和7-AAD，室溫避光孵育15分鐘即可。由于此法中細胞未固定，因此需在染色后盡快檢測；

5. 分析軟件：Cell Quest；

6. 圈門(mén)策略及染色：FSC/SSC圈門(mén)策略請視不同細胞而定；

7. 常見(jiàn)問(wèn)題小貼士：

A. 由于細胞凋亡因細胞種類(lèi)、細胞所在體內環(huán)境、體外給予的刺激、染色過(guò)程中的操作不同而迥異，因此Annexin V和7-AAD雙染檢測凋亡，需要按照各自具體情況進(jìn)行多次實(shí)驗，以掌握自己實(shí)驗條件下細胞凋亡的套路。

B. Annexin V染色的常見(jiàn)特性如上圖所示，即使未凋亡的細胞（Annexin V-7-AAD-細胞），經(jīng)過(guò)染色后在流式圖上的位置也會(huì )右移，小白曾經(jīng)和多位做過(guò)凋亡的伙伴們交流過(guò)，這種現象是Annexin V染色特有的，請大家不要奇怪。小白曾經(jīng)試圖通過(guò)洗去多余抗體來(lái)將活細胞群（Annexin V-7-AAD-細胞群）調整到我們通常認為的“陰性細胞”位置，但是從實(shí)例圖中大家也能發(fā)現這種方法是行不通的。至于為什么洗去多余抗體不能解決“移位”問(wèn)題，請恕小編才疏學(xué)淺，至今還不知道原因，只是建議大家不要采用洗多余抗體的方法來(lái)調整細胞在圖上出現的位置，相信大家也發(fā)現了洗過(guò)之后，各群細胞比例已經(jīng)發(fā)生改變了。

C. 由于平時(shí)實(shí)驗中的細胞來(lái)之不易，久而久之便養成了節約的好習慣，所以本實(shí)例中采用的細胞數量較少，如果小伙伴們采用的細胞數量可以土豪到106級別，可采用300ul-500ul體系，加2ul-5ul Annexin V和10ul 7-AAD，具體染色條件請自行采取滴度實(shí)驗。

D. 使用Annexin V和PI試劑盒的童鞋染色也可按照試劑盒說(shuō)明來(lái)操作。

E. 此法的上機檢測過(guò)程沒(méi)有特別之處，與一般分子的上機檢測類(lèi)同，小伙伴們無(wú)需多慮。只是提醒一下使用PI的小伙伴們，PI的發(fā)射譜很寬，可以用第二或第三通道來(lái)檢測，大家任選其一即可。另外，小伙伴們要特別注意在FSC/SSC圈門(mén)時(shí)，所選細胞范圍會(huì )對結果造成較大影響，大家自己分析的時(shí)候就會(huì )發(fā)現這一點(diǎn)，所以小伙伴們在分析的時(shí)候要把所有分析對象都圈進(jìn)FSC/SSC的門(mén)內，這樣才能反映真實(shí)情況。

F. 本法的優(yōu)點(diǎn)在于無(wú)需固定細胞、染色快速，但是缺點(diǎn)是當細胞膜破裂時(shí)Annexin V也可與細胞結合，而且在一些自噬受損的細胞中，PS外翻可能受阻，所以此時(shí)Annexin V就不再適合用于早期凋亡檢測了。