由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲瓚產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加，也會(huì )對實(shí)驗結果的準確性產(chǎn)生影響，而且溶解甲瓚的有機溶劑對實(shí)驗者也有損害。關(guān)于MTT法，上次中洪君也有推送過(guò)：實(shí)驗專(zhuān)欄丨這5年做MTT實(shí)驗的總結都在這兒了。

為此，Oween等設計出了一種新型的MTT類(lèi)似物一MTS，MTS法原理同MTT法，但優(yōu)于MTT法。MTS在PMs(Phenazinemethosulfate)的存在下可被活細胞還原形成水溶性的甲增產(chǎn)物(故MTS需與PMS合用)，因而被用來(lái)建立了可檢測細胞活力和增殖能力的MTS檢測法。 MTS形成的水溶性甲臘產(chǎn)物在490~500nm處有最佳吸收，我們一般選擇492nm。每孔檢測的細胞數量在3000~5000為宜，作用一小時(shí)后即可檢測，以3小時(shí)的檢測結果為最佳。

與MTT法相比，MTS有以下優(yōu)點(diǎn)

? 1、操作簡(jiǎn)便，MTS中生成的甲脂極具水溶性，省去了MTT法需離心除去上清液和加入有機溶劑這一步驟，可一次檢測大量樣品。 

? 2、MTS易于配制和儲存，在PH>6.5的緩沖溶液中易溶解配成溶液，且可在4 ℃下保存一段時(shí)間。 

? 3、快速，加入藥后一小時(shí)即可檢測結果（2-3小時(shí)為最佳），而MTT法的作用4個(gè)小時(shí)。 

? 4、敏感，比MTT法測定統一樣品敏感性高。 

? 5、特異性強，MTT法形成的甲增產(chǎn)物為桔黃色，培養體系中一些黃色代謝產(chǎn)物和試劑均可影響檢測結果，而MTS/PMS法形成的甲增產(chǎn)物為深棕色檢測時(shí)外部因素影響較小，所以特異性較強。 

? 6、重復性良好。

MTS法的原理：

還原為黃色的Fo圖為MTS被乳酸脫氫酶rmazan

MTS檢測細胞增殖protocol:

1）收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入100ul，鋪板使待測細胞調密度3000~5000/孔，5%CO2，37℃孵育。 

2）24小時(shí)后吸去培養基，每孔加入100ulMTS溶液，即MTS母液與培養基比例為1:9，繼續培養1-3h。在酶標儀OD492nm處測量各孔的吸光值。 

3）連續檢測3天，每天3復孔，在酶標儀OD490nm處測量各孔的吸光值。 

4）記錄3天的各孔吸光值，使用GraphPad prism軟件計算細胞增殖曲線(xiàn)。

MTS操作注意事項：

1、MTS需避光，所以操作時(shí)應注意避光。 

2、培養過(guò)程中換液，如果培養時(shí)間較長(cháng)，應適當更換細胞培養液，補充營(yíng)養物質(zhì)。

3、防止邊緣效應，96孔板邊緣應該滴加PBS，邊緣孔的水分揮發(fā)較快，藥物易被濃縮，對實(shí)驗影響大。邊緣孔加入PBS 溶液后能夠在一定程度上保持實(shí)驗組的水分。

中洪實(shí)驗室細胞增殖檢測法推薦

1、細胞類(lèi)型，如果是懸浮細胞，MTT方法則不適用，MTT需要吸取上清后再加入DMSO溶解甲臜，而懸浮細胞不貼壁，容易造成結果不準確 。

2、細胞數，如果細胞數少于500，則推薦使用基于A(yíng)TP的檢測方法，該方法較為靈敏，能夠檢測很少的細胞數。

3、檢測時(shí)間，如果實(shí)驗時(shí)間不允許，需要短時(shí)間出穩定準確的實(shí)驗結果，推薦采用基于其他氧化還原酶的檢測和基于A(yíng)TP的檢測方法。

4、藥物處理。如有藥物處理，且藥物具有氧化性，則不推薦MTT， 氧化性的藥物會(huì )和MTT發(fā)生氧化還原反應而影響MTT法的試驗結果。另外如果藥物帶有顏色，推薦采用基于A(yíng)TP的檢測方法。

5、高通量篩選。推薦采用MTS，CCK-8這兩種方法，操作較為簡(jiǎn)單，且價(jià)格便宜。但如果是藥物的高通量篩選，且藥物處理時(shí)間較短，帶有顏色，推薦采用基于A(yíng)TP的檢測方法。

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