介紹： 

材料與方法： 

   PCR使用的標準溶液和試劑 

   100 mM 母液的核苷酸 (dNTP) ( 購于 Pharmacia Biotech [Piscataway, NJ, USA] 或 Boehringer Mannheim [Indianapolis, IN, USA]) (25 mM each dATP, dCTP, dGTP and dTTP). 

   標準的 10xPCR 緩沖液 (Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA) 包含： 500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl, pH 8.3[at 24 ℃ ], 15 mM MgCl 2 . 

   Taq DNA 聚合酶 (Life Technologies [Gaithersburg, MD, USA]; Perkin-Elmer). 

   二甲亞砜 (DMSO), 牛血清蛋白 (BSA), 甘油 (Sigma Chemical [St. Louis, MO, USA]) 

   引物 (Genosys [The Woodlands, TX, USA]; Research Genetics [Huntsville, AL, USA])( 終濃度為 10–25 pmol/μL 。引物對 sY 用作檢測 Y 染色體上的缺失 (8,16) ；還有 10–15 對引物用于檢測 X 染色體上迪謝內肌營(yíng)養不良基因 (DMD) (4) ；其余引物用于檢測 12 號染色體上的多態(tài)性位點(diǎn)，引物按 Table 1 和 Figures 2b, 3b,5e 方案組合。 

   基因組 DNA 使用標準 SDS/ 蛋白酶 K 方法制備 (Boehringer Mannheim) 

基本 PCR程序 

   PCR 反應體積為 25μL ，包括：滅菌的超純水、 PCR 緩沖液 (1x) 、 dNTP 混合物 (200μM each) 、引物 (0.04–0.6μM each); DMSO, 甘油或 BSA (5%); Taq DNA 聚合酶 (1–2 U/25μL) 和基因組 DNA 模板 (150ng/25μL) 。先加入水，其它組分可以任意順序加入，加樣在冰上進(jìn)行，加樣完成后反應管直接從冰上轉入預熱到 94 ℃的循環(huán)儀加熱模塊或水浴中。對于放射性標記的反應，在反應開(kāi)始前立即在 100μL 的反應混合液中加入 1 μCi [ 32 P] dCTP (Amersham, Arlington Heights, IL,USA) 。使用 100μL 、 25μL 、 6.2μL 反應體積得到的結果相同，對于小的反應體積，加樣（尤其是 dNTP ）至關(guān)重要。實(shí)驗中使用了各種 PCR 儀，經(jīng)過(guò)細微調節后都得到了好的實(shí)驗結果。 

PCR產(chǎn)物的凝膠分析 

   在 3%SeaKem ? LE 或 NuSieve ? (3:1) 瓊脂糖凝膠 (FMC BioProducts, Rockland, ME, USA) 上對 X 、 Y 染色體上非多態(tài)性位點(diǎn)的 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行分離，電泳緩沖液分別為 1xTAE [0.04M Tris-acetate; 0.001 M EDTA (pH8.0)] 或 1xTBE [0.09 M Tris-borate; 0.002 M EDTA (pH 8.0)] 緩沖液，電泳在室溫下進(jìn)行，電場(chǎng)強度為 7–10V/cm 。 PCR 產(chǎn)物的上樣體積相同，電泳后凝膠用 0.5–1 μ g/mL EB 染色。 

   當檢測位點(diǎn)為多態(tài)性位點(diǎn)或需要更高的分辨率時(shí)使用測序膠 (6% 聚丙烯酰胺 [PAA]/7 M 尿素 ) 。與上樣緩沖液混勻后，每泳道加入約 0.2 μ L 放射性標記的 PCR 產(chǎn)物。凝膠在 0.6xTBE 緩沖液中在 1800–2000 V (60A) 條件下電泳兩小時(shí)。過(guò)夜曝光后得到自顯影圖像。 

結果與討論 : 

   在大量實(shí)驗的基礎上，如 Figure1 所示設計出了多重 PCR 的標準方法，其中也包括了許多經(jīng)常遇到的問(wèn)題的解決方案。為了便于使用，用斜體字將步驟表與材料和方法中的各點(diǎn)及以下部分聯(lián)系起來(lái)。