熒光定量pcr實(shí)驗步驟
1、總RNA抽提（槍頭和離心管均經(jīng)過(guò)濕熱滅菌，無(wú)RNA酶）
1）取勻漿器，加入1ml的Trizol Reagent，置冰上預冷。
2）取100mg組織，加入到勻漿器中。
3）充分研磨直至無(wú)可見(jiàn)組織塊。
4）13000g離心10min取上清。
5）加入250 μl三氯甲烷，顛倒離心管15s，充分混勻，靜置3min。
6）4℃下13000g離心8min。
7）將上清轉移到一新的離心管中，加入0.8倍體積的異丙醇，顛倒混勻。
8）-20℃放置15min。
9）4℃下13000g離心10min，管底的白色沉淀即為RNA。
10）吸除液體，加入75%乙醇1.5ml洗滌沉淀。
11）4℃下13000g離心5min。
12）將液體吸除干凈，將離心管置于超凈臺上吹3min。
13）加入20μl無(wú)RNA酶的水溶解RNA。
14）55℃孵育5min。
2、反轉錄（槍頭和PCR均經(jīng)過(guò)濕熱滅菌，無(wú)RNA酶）
1）取一PCR管，加入含2μg RNA的溶液。
2）加入1μl oligo(dT)15。
3）用無(wú)核糖核酸酶的去離子水補足至12μl。
4）于PCR儀上70℃保溫5min，迅速置冰上冷卻。
5）依次加入4μl 5×buffer，2μl 10mM dNTPs，1μl RNA inhibitor和1μl 反轉錄酶，用槍抽吸混勻。
6）于PCR儀上42℃保溫60min，結束后80℃保溫5min滅活反轉錄酶。
3、定量PCR
1）取0.2ml PCR管，配制如下反應體系，每個(gè)反轉錄產(chǎn)物配制3管。
2× qPCR Mix 12.5μl
7.5μM基因引物 2.0μl
反轉錄產(chǎn)物 2.5μl
ddH2O 8.0μl
2）取0.2ml PCR管，配制如下反應體系，每個(gè)反轉錄產(chǎn)物配制3管。
2×qPCR Mix 12.5μl
7.5μM內參引物 2.0μl
反轉錄產(chǎn)物 2.5μl
ddH2O 8.0μl
3）PCR擴增
預變性 95℃，10min
循環(huán)（40次） 95℃，15s→60℃，60s
溶解曲線(xiàn) 75℃→95℃，每20s升溫1℃
4、結果處理
ΔΔCT法：
A=CT(目的基因，待測樣本)- CT(內標基因，待測樣本)
B=CT(目的基因，對照樣本)- CT(內標基因，對照樣本)
K=A-B
表達倍數=2-K
注意事項
1、長(cháng)度：15—30bp。
2、G十c含量：應在40%一60%之間。
3、堿基分布的隨機性
4、引物自身：最好不要含有自身互補序列，否則會(huì )形成發(fā)夾樣二級結構。
5、引物之間：兩個(gè)引物之間不應有多于4個(gè)的互補或同源堿基，不然會(huì )形成引物二聚體，尤應避免3’端的互補重疊。
6、上下游引物的互補性：一個(gè)引物的3‘末端序列不允許結合到另一個(gè)引物的任何位點(diǎn)上。
7、3’末端：如果可能的話(huà)，每個(gè)引物的3‘末端堿基應為G或C。
8、設計RT-PCR的引物時(shí)，上下游引物要跨內含子，以消除基因組DNA的干擾。
9、引物設計好后再NCBI上進(jìn)行序列比對，檢查是否可能有錯配產(chǎn)物擴增。
10、引物設計要注意種屬。
