pcr引物設計的11條黃金法則 

   DNA序列的保守區是通過(guò)物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過(guò)序列分析軟件（比如DNAman）比對（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區。 

   引物長(cháng)度（primer length）常用的是18-27 bp，但不應大于38，因為過(guò)長(cháng)會(huì )導致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA 聚合酶進(jìn)行反應。 

   GC含量（composition）過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動(dòng)溫度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使復性條件最佳。 

   如擴增編碼區域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì )影響擴增的特異性與效率。 

   引物3′端錯配時(shí)，不同堿基引發(fā)效率存在著(zhù)很大的差異，當末位的堿基為A時(shí)，即使在錯配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當末位鏈為T(mén)時(shí)，錯配的引發(fā)效率大大降低，G、C錯配的引發(fā)效率介于A(yíng)、T之間，所以3′端最好選擇T. 

  引物序列在模板內應當沒(méi)有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導致錯誤引發(fā)（False priming）。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應超過(guò)3個(gè)連續的G 或C，因這樣會(huì )使引物在GC富集序列區錯誤引發(fā)。 

   引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會(huì )折疊成發(fā)夾結構（Hairpin）使引物本身復性。這種二級結構會(huì )因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。引物自身不能有連續4個(gè)堿基的互補。 

    引物二聚體及發(fā)夾結構如果不可避免的話(huà)，應盡量使其△G值不要過(guò)高（應小于4.5kcal/mol）。否則易導致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR 反應不能正常進(jìn)行。  

   △G值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結構內部堿基對的相對穩定性，△G值越大，則雙鏈越穩定。應當選用5′ 端和中間△G值相對較高，而3′ 端△G值較低（絕對值不超過(guò)9）的引物。引物3′ 端的△G 值過(guò)高，容易在錯配位點(diǎn)形成雙鏈結構并引發(fā)DNA 聚合反應。（不同位置的△G值可以用Oligo 6軟件進(jìn)行分析） 

   引物的5′ 端決定著(zhù)PCR產(chǎn)物的長(cháng)度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5′ 端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結合DNA序列；引入點(diǎn)突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動(dòng)子序列等。 

引物的延伸是從3′ 端開(kāi)始的，不能進(jìn)行任何修飾。3′ 端也不能有形成任何二級結構可能。