平頭連接是將制備好的平頭載體和補平或削平的PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行連接。載體可用EcoR V或Sma I切成平頭；PCR產(chǎn)物純化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用該酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。如果要求不高，PCR產(chǎn)物也可不加處理。如果使用Stratagene公司的pfu DNA聚合酶或New England Biolabs公司的Vent DNA聚合酶，這兩種酶有5’→3’校對能力，擴增出來(lái)的PCR產(chǎn)物已經(jīng)是平頭，可以不作平端處理。平端連接的一個(gè)顯而易見(jiàn)的缺陷是連接效率低下，即使使用很高單位的連接酶，或在反應體系中加入PEG 8000，也只能很有限地提高效率。

   粘頭連接也可以大致分為兩類(lèi)，一類(lèi)粘頭連接是用某種方法，在載體和PCR產(chǎn)物上產(chǎn)生長(cháng)的可互補的粘性末端。最普遍的方法是在引物的5’端加入一段某種限制酶的識別序列。如果兩個(gè)引物選用不同的限制性?xún)惹忻缸R別序列，就可以做到定向連接。另一類(lèi)利用部分PCR產(chǎn)物3’端帶有一個(gè)凸出的dAMP的特性，構建3’端帶有凸出的dTMP的載體。一般采用的方法是先把載體用某種限制性?xún)惹忻赶善筋^，在70℃或72℃下在只加入一種dNTP、即dTTP的反應體系中用Taq DNA聚合酶處理半小時(shí)（也有人報道處理1～2小時(shí)能提高克隆效率，這樣加T反應會(huì )更徹底）。也可以用末端轉移酶來(lái)完成加T反應。載體自連、PCR產(chǎn)物串連可以忽略。如果使用ddTTP，效果會(huì )更好。這種方法一般稱(chēng)為加T/A法克隆，比平頭連接效率高50～100倍。

1. TA克隆構建原理：TA克隆系統由Invitrogen公司（San Diego，CA）發(fā)展而來(lái)的商業(yè)性試劑盒，它用于PCR產(chǎn)物的克隆和測序。其原理是利用Taq酶能夠在PCR產(chǎn)物的3’末端加上一個(gè)非模板依賴(lài)的A，而T載體是一種帶有3’T突出端的載體，在連接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR產(chǎn)物直接插入到質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)（MCS）中。

2.操作步驟

   ⑴ 連接反應一般在滅菌的0.5ml離心管中進(jìn)行。

   ⑵ 10μl體積反應體系如下：

   ①取T載體1μl (50ng)，加入等摩爾數PCR產(chǎn)物 。

   ②加入含ATP的10×Buffer 1μl，T4 DNA連接酶合適單位，用ddH2O 補足至10μl 。

   ⑶ 稍加離心，通常為14-16℃水浴連接8-14hr，或4℃過(guò)夜。

   ⑷ 轉染，藍白斑篩選同前。

    1.要獲得目的基因的TA克隆，PCR產(chǎn)物的特異性要好。

    2.PCR產(chǎn)物在TA克隆前要通過(guò)純化。

    3.在PCR產(chǎn)物回收、純化過(guò)程中防止外來(lái)DNA污染。