定量PCR實(shí)驗技術(shù)分享
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發(fā)布時(shí)間：2016-09-20
1. 如果擴增曲線(xiàn)ct值比較靠后的話(huà)，32左右，一般有什么方法解決沒(méi)有
ct值比較靠后，對實(shí)驗有一定的影響，因為經(jīng)過(guò)那么多次的循環(huán)，酶的活性有可能有所下降，這時(shí)候擴增效率會(huì )有所改變（而定量PCR的理論基礎就是每次循環(huán)的擴增效率我們認為是確定的一個(gè)值）。因此最好能夠把ct值往前移。
解決辦法可以將模板加以濃縮或者抽干之后用少量水去溶解。
2. 為什么合成的引物做不加摸板的對照也能擴增出目的條帶，而內參用同樣體系就沒(méi)有呢?
引物被污染。
3. 實(shí)時(shí)定量PCR，熒光定量PCR，實(shí)時(shí)熒光定量PCR，real－time PCR，這些是不是同一個(gè)概念
是一個(gè)概念。
4. 我的標準曲線(xiàn)的slope總是大于４，而且每個(gè)梯度的平行ct值差別比較大，原因？
這個(gè)斜率是＝1/LOG 10(擴增效率)，理論上擴增效率＝2，斜率是3.322。如果斜率大于4，說(shuō)明擴增效率比較小?？梢钥疾橐幌路磻w系是否合理？酶活是否正常？
平行管的CT值差別大可以考查一下自己實(shí)驗操作是否規范，另外一種原因就是儀器本身的誤差也可能會(huì )導致CT值差別比較大。
當斜率為4的時(shí)候，擴增效率是77.8%，斜率大于4的話(huà)，效率繼續下降。
擴增效率的問(wèn)題實(shí)際就是引物的擴增效率，可能酶活的關(guān)系沒(méi)有那么重要，前提是試劑盒的質(zhì)量有保證?；氐綌U增效率，只有在引物和模板處于最適比例時(shí)才能得到比較滿(mǎn)意的擴增效率，因此通過(guò)調節PCR反應體系中的引物終濃度來(lái)解決，可以做一些引物梯度來(lái)比較。
5. ROX染料是什么作用？
ROX的作用ABI宣稱(chēng)是用來(lái)校準加樣誤差的。
但是據說(shuō)ROX的作用實(shí)際上是用來(lái)校準光程差的。即每個(gè)孔的熒光信號經(jīng)過(guò)濾光片在經(jīng)過(guò)聚焦到CCD的時(shí)候，走過(guò)的光程是不一樣的，這樣在CCD上成像的亮度就不一樣了。所以需要把這個(gè)差異用ROX來(lái)計算孔間差異有多大，然后差異系數去處理，實(shí)際的熒光信號。具體過(guò)程我不是非常清楚，請高手指正。
6. 熒光定量PCR的基線(xiàn)，是怎么確定的呢？
基線(xiàn)就是背景值，因此就是曲線(xiàn)在沒(méi)有“起跳”之前的一段。在軟件上有一個(gè)地方可以輸入baseline從第幾到第幾cycle作為基線(xiàn)。設置原則是使沒(méi)有起跳之前最多的cycle的信號接近0。
7. 我剛準備做定量，請教一下，不知道伯樂(lè )的機子怎么樣？請推薦幾個(gè)合適的ＳＹＢＲ?。牵遥牛牛蔚暮凶?，１０００以?xún)鹊模](méi)錢(qián)不好辦?。?，我大約做２０個(gè)樣?，F在對ＳＹＢＲ?。牵遥牛牛握J可嗎？
伯樂(lè )的機子不錯。takara的試劑盒，大概在1500元，400個(gè)反應。大部分人做還是用sybr green I的。這是最常用的染料。
