AFLP（amplified fragment length polymorphism，擴增片段長(cháng)度多態(tài)性）是由荷蘭科學(xué)家Pieter Vos等于1995年發(fā)明的分子標記技術(shù)。文章發(fā)表于《Nucleic Acids Research》Vol.23。AFLP是基于PCR技術(shù)擴增基因組DNA限制性片段，基因組DNA先用限制性?xún)惹忻盖懈?，然后將雙鏈接頭連接到DNA片段的末端，接頭序列和相鄰的限制性位點(diǎn)序列，作為引物結合位點(diǎn)。限制性片段用二種酶切割產(chǎn)生，一種是罕見(jiàn)切割酶，一種是常用切割酶。

    它結合了RFLP和PCR技術(shù)特點(diǎn)，具有RFLP技術(shù)的可靠性和PCR技術(shù)的高效性。由于A(yíng)FLP擴增可使某一品種出現特定的DNA譜帶，而在另一品種中可能無(wú)此譜帶產(chǎn)生，因此，這種通過(guò)引物誘導及DNA擴增后得到的DNA多態(tài)性可做為一種分子標記。

     AFLP技術(shù)是基于PCR反應的一種選擇性擴增限制性片段的方法。由于不同物種的基因組DNA大小不同，基因組DNA經(jīng)限制性?xún)惹忻该盖泻?，產(chǎn)生分子量大小不同的限制性片段。使用特定的雙鏈接頭與酶切DNA片段連接作為擴增反應的模板，用含有選擇性堿基的引物對模板DNA進(jìn)行擴增，選擇性堿基的種類(lèi)、數目和順序決定了擴增片段的特殊性，只有那些限制性位點(diǎn)側翼的核苷酸與引物的選擇性堿基相匹配的限制性片段才可被擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)放射性同位素標記、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后根據凝膠上DNA指紋的有無(wú)來(lái)檢驗多態(tài)性[5]。Vos等（1995）曾對AFLP的反應原理進(jìn)行了驗證，結果檢測到的酶切片段數與預測到的酶切片段數完全一致，充分證明了AFLP技術(shù)原理的可靠性。

    進(jìn)行AFLP分析時(shí)，一般應用兩種限制性?xún)惹忻冈谶m宜的緩沖系統中對基因組DNA進(jìn)行酶切，一種為低頻剪切酶，識別位點(diǎn)為六堿基的rare cutter；另一種為高頻剪切酶，識別位點(diǎn)為四堿基的frequent cutter。雙酶切產(chǎn)生的DNA片段長(cháng)度一般小于500 bp，在A(yíng)FLP反應中可被優(yōu)先擴增，擴增產(chǎn)物可被很好地分離，因此一般多采用稀有切點(diǎn)限制性?xún)惹忻概c多切點(diǎn)限制性?xún)惹忻赶啻钆涫褂玫碾p酶切。目前常用的兩種酶是4個(gè)識別位點(diǎn)的Mse I和6個(gè)識別位點(diǎn)的EcoR I。

     AFLP反應程序主要包括模板DNA制備，酶切片段擴增及凝膠電泳分析這3個(gè)基本步驟。各步驟具體的過(guò)程有：

     1.  首先要制備高分子量（HMW）基因組DNA，選擇6個(gè)堿基識別位點(diǎn)的限制性?xún)惹忻福ㄍǔＪ荅coRI或PstI或SacI）。

     2.  酶切后的限制性片段在T4連接酶的作用下與特定的接頭相連接，形成帶有接頭的特異性片段。

     3.  DNA片段的預擴增。

     4.  在Taq聚合酶的作用下，完成AFLP的選擇性擴增。

     5. PCR產(chǎn)物變性后在含尿素的聚丙烯酰胺變性膠上電泳。

     6.   多態(tài)性比較分析，特異片段回收克隆分析。

     7.  Genomic AFLP。

     8.  cDNA-AFLP。

      AFLP具有可靠性好，重復性強，可信度高等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)廣泛應用于遺傳育種研究，在動(dòng)物遺傳育種、動(dòng)物基因組研究中有著(zhù)廣泛的應用前景。如：

      1.  構建遺傳連鎖圖譜。

      2.  利用AFLP快速鑒別與目的基因緊密連鎖的分子標記。

      3.  AFLP輔助的輪回選擇育種。

      4.  利用AFLP技術(shù)研究基因表達與調控。

      5.  分類(lèi)和進(jìn)化研究。

      6.  甲基化研究。

     （1）分析所需 DNA 量少，僅需 0.5 μg。也可以用作于線(xiàn)粒體 DNA。從線(xiàn)粒體中得到RFLP 研究所需的幾十到上百μg 的 DNA 是很困難的。Roseudahl 和 Taylor（1997） 成功地從一種真菌（Mycorrhizal fungi） 的單個(gè)孢子中得到 AFLP 標記，而每個(gè)單孢子僅產(chǎn)生約0.1～0.5 μg DNA。另

外，AFLP 反應對模板濃度的變化不敏感，DNA 濃度在 1000 倍的范圍內變化時(shí)對反應的影響都不太大，所產(chǎn)生的指紋圖譜十分相似。

    （2）可重復性好。AFLP分析基于電泳條帶的有或無(wú)，高質(zhì)量的DNA和過(guò)量的酶可以克服因DNA酶切不完全而產(chǎn)生的失真，PCR中較高的退火溫度和較長(cháng)的引物可將擴增中的錯誤減少到最低限度，因而AFLP分析具有很強的可重復性。Jones等（1997）在歐洲8個(gè)實(shí)驗室使用共同的樣本，進(jìn)行嚴格的實(shí)驗，將得到的DNA圖譜進(jìn)行比較，172條譜帶中僅一條出錯，誤差小于0.6% 。

    （3）多態(tài)性強。AFLP 分析可以通過(guò)改變限制性?xún)惹忻负瓦x擇性堿基的種類(lèi)與數目，來(lái)調節擴增的條帶數，具有較強的多態(tài)分辨能力。設計不同的人工接頭就會(huì )相應地產(chǎn)生不同的 AFLP 引物，引物 3'端的選擇性堿基數目可以是 2+2， 2+3 也可以是 3+3，這些堿基的組成也是多種多樣的。由于 AFLP 引物設計的巧妙與搭配的靈活，使得 AFLP 能產(chǎn)生的標記數目是無(wú)限的。迄今為止，每個(gè) AFLP 反應能檢出多態(tài)片段之多，信息量之大，效率之高是其它任何一種分子標記所無(wú)法比擬的。

    （4）分辨率高。AFLP 擴增片段短，適合于變性序列凝膠上電泳分離，因此片段多態(tài)性檢出率高，而 RFLP 片段相對較大，內部多態(tài)性往往被掩蓋。

    （5）不需要 Southern 雜交，無(wú)放射性危害，且不需要預先知道被分析基因組 DNA的序列信息，是一種半隨機的 PCR。

    （6）樣品適用性廣。AFLP 技術(shù)適用于任何來(lái)源和各種復雜度的DNA ，如基因組山東農業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文29DNA、cDNA、質(zhì)粒、某一個(gè)基因或基因片段，且不需要預知這些DNA 的序列特征。用同樣一套限制酶、接頭和引物，可對各種生物的DNA 進(jìn)行分子遺傳標記研究。

    （7）穩定的遺傳性 AFLP 標記在后代中的遺傳和分離中符合Mendel式遺傳規律，種群中的 AFLP 標記位點(diǎn)遵循 Hardy－Weinberg 平衡總之，在技術(shù)特點(diǎn)上，AFLP 實(shí)際上是 RAPD 和 RFLP 相結合的一種產(chǎn)物。它既克服了 RFLP 技術(shù)復雜、有放射性危害和 RAPD穩定性差，標記呈現隱性遺傳的缺點(diǎn)；同時(shí)又兼有二者之長(cháng)。近幾年來(lái)，人們不斷將這一技術(shù)完善、發(fā)展，使得 AFLP 迅速成為迄今為止最有效的分子標記。