中洪博元生物  流式細胞檢測 促銷(xiāo)進(jìn)行中

一、簡(jiǎn)介

       主要是根據細胞凋亡時(shí)在細胞、亞細胞和分子水平上所發(fā)生的特征性改變。這些改變包括細胞核的改變、細胞器的改變、細胞膜成分的改變和細胞形態(tài)的改變等，其中細胞核的改變最 具特征性，主要包括以下幾個(gè)方面：

       1.細胞核的改變：由于凋亡細胞核的改變，造成各種染色體熒光染料對凋亡細胞DNA可染性發(fā)生改變。研究表明，用各種染色體熒光染料對經(jīng)固定的凋亡細胞進(jìn)行染色，其DNA可染性降低。許多學(xué)者把這種DNA可染性的降低認為是凋亡細胞的標志之一。

       2.光散射特性：凋亡細胞形態(tài)上的改變影響它們的光散射特性。在流式細胞儀上，前散射光與細胞的大小有關(guān)，而側散射光反映的是光在細胞內的折射作用，與細胞內的顆粒多少有關(guān)。在細胞凋亡時(shí)，細胞固縮，體積變小，故前散射光降低，這一特性往往被認為是凋亡細胞的特點(diǎn)之一。此外細胞凋亡時(shí)由于染色體降解，核破裂形成，細胞內顆粒往往增多，故凋亡細胞側散射光常增加。細胞壞死時(shí)，由于細胞腫脹，其前散射光增大；側散射光在細胞壞死時(shí)也增大，因此可根據前散射光和側散射光區別凋亡細胞和壞死細胞。但需要注意的是，根據前散射光和側散射光判斷凋亡細胞的可靠性受被檢測細胞形態(tài)上的均一性和核胞漿比率影響很大。因此在某些淋巴細胞凋亡中，用光散射特性檢測凋亡的可靠性較好，而在腫瘤細胞凋亡中，其可靠性就較差。根據光散射特性檢測凋亡細胞最主要的優(yōu)點(diǎn)是可以將光散射特性與細胞的表面免疫熒光分析結合起來(lái)，用以區別經(jīng)這些特殊處理發(fā)生選擇性凋亡的淋巴細胞亞型。也可用于活細胞的分類(lèi)。

簡(jiǎn)要的實(shí)驗步驟

    1.收集細胞｛數目約（1~ 5）×106個(gè)/mL｝，500 ~ 1000 r/min離心5min，棄去養液。
    2.3mlP洗滌1次。
    3.離心去PBS，加入冰預冷的70%的乙醇固定，4℃，1—2小時(shí)。
    4.離心棄去固定液，3mlPBS重懸5min。
    5.400目的篩網(wǎng)過(guò)濾1次，500—1000r/min離心5min，棄去PBS。 
    6.用1mlPI染液染色，4℃避光30min。
    7.流式細胞儀檢測：PI用氬離子激發(fā)熒光，激光光波波長(cháng)為488nm，發(fā)射光波波長(cháng)大于630nm，產(chǎn)生紅色熒光分析PI熒光強度的直方圖也可分析前散射光對側散射光的散點(diǎn)圖。
    8.結果判斷：在前散射光對側散射光的散點(diǎn)圖或地形圖上，凋亡細胞與正常細胞相比，前散射光降低，而側散射光可高可低，與細胞的類(lèi)型有關(guān)；在分析PI熒光的直方圖時(shí)，先用門(mén)技術(shù)排除成雙或聚集的細胞以及發(fā)微弱熒光的細胞碎片，在PI熒光的直方圖上，凋亡細胞在G1/G0期前出現一亞二倍體峰。如以G1/G0期所在位置的熒光強度為1.0，則一個(gè)典型的凋亡細胞樣本其亞二倍體峰的熒光強度為0.45，可用雞和鮭魚(yú)的紅細胞的PI熒光強度做參照標準，兩者分別為0.35和0.7，可以確保在兩者之間的不是細胞碎片而是完整的細胞。

 注意事項

    細胞凋亡時(shí)，其DNA可染性降低被認為是凋亡細胞的標志之一，但這種DNA可染性降低也可能是因為DNA含量的降低，或者是因為DNA
結構的改變使其與染料結合的能力發(fā)生改變所致。在分析結果時(shí)應該注意。

 部分實(shí)例展示