EMSA又稱(chēng)作凝膠遷移實(shí)驗，這個(gè)實(shí)驗是每個(gè)實(shí)驗者的必做實(shí)驗??！是一種用于蛋白與核算相互作用的技術(shù)。最初是用于轉錄因子與啟動(dòng)子相互作用的驗證性實(shí)驗，也可應用與蛋白-DNA、蛋白-RNA互作研究。

實(shí)驗目的：

凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗（EMSA）可以：（1）研究DNA結合蛋白和其相關(guān)的DNA結合序列相互作用；（2）可用于DNA定性和定量分析；（3）用于研究RNA結合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

實(shí)驗過(guò)程：

一、樣品的制備：包括探針的標記準備，探針的純化和凝膠的制備

1、探針的標記準備：

（1）如下設置探針標記的反應體系：總體積 10微升

待標記探針 （1.75pmol/微升）	2微升
T4  Polynucleotide Kinase Buffer （10X）	1微升
Nuclease-Free  Water	5微升
[γ-32P]ATP（3,000Ci/mmol at 10mCi/ml）	1微升
T4  Polynucleotide Kinase （5-10U/微升）	1微升

按照上述反應體系依次加入各種試劑，加入同位素后，Vortex混勻，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混勻。

（2） 使用水浴或PCR儀，37℃反應10分鐘。

（3） 加入1微升探針標記終止液，混勻，終止探針標記反應。

（4） 再加入89微升TE,混勻。此時(shí)可以取少量探針用于檢測標記的效率。通常標記的效率在30%以上，即總放射性的30%以上標 記到了探針上。為實(shí)驗簡(jiǎn)便起見(jiàn)，通常不必測定探針的標記效率。

（5） 標記好的探針最好立即使用，最長(cháng)使用時(shí)間一般不宜超過(guò)3天。標記好的探針可以保存在-20℃。

二、探針的純化：

通常為實(shí)驗簡(jiǎn)便起見(jiàn)，可以不必純化標記好的探針。在有些時(shí)候，純化后的探針會(huì )改善EMSA的電泳結果。如需純化，可以按照如 下步驟操作：

（1） 對于100微升標記好的探針，加入1/4體積即25微升的5M醋酸銨，再加入2體積即200微升的無(wú)水乙醇，混勻。

（2） 在-70℃至-80℃沉淀1小時(shí)，或在-20℃沉淀過(guò)夜。

（3） 在4℃，12000g-16000g離心30分鐘。小心去除上清，切不可觸及沉。

（4） 在4℃，12000g-16000g離心1分鐘。小心吸去殘余液體。微晾干沉淀，但不宜過(guò)分干燥。

（5） 加入100微升TE，完全溶解沉淀。標記好的探針最好立即使用，最長(cháng)使用時(shí)間一般不宜超過(guò)3天。標記好的探針可以保存于-20℃。

三、凝膠的制備：

（1）  制備6.5%非變性聚丙烯酰胺凝膠：（注意根據試劑情況按比例調整總體積）

5XTBE	1ml
30%Acrylamide/Bis	2.2ml
deionized,sterilewater	6.62ml
80%Glycerol（甘油）	80μl
10%AP（硫酸氨）	90μl
TEMED（四甲基乙二氨）	10μl
總體積	10ml

（2）按標準步驟制備凝膠。

（3）加樣前先在預冷的0.5X TBE buffer中120V預電泳10min，與電泳完畢后沖洗加樣孔。

（4）混合樣本及電泳緩沖液，點(diǎn)樣電泳。

（5）將電泳槽置于冰上或者4℃環(huán)境中，恒壓100V進(jìn)行電泳，直至緩沖液指示帶距離凝膠底部2~3cm為止。（大約50-60min，根據實(shí)際情況調整電泳時(shí)間及電壓；電泳時(shí)間不宜過(guò)長(cháng)）

EMSA的結合：

1、設置如下EMSA結合反應

陰性對照反應：

（1）Nuclease-Free Water ：7微升。

（2）EMSA/Gel-Shift結合緩沖液(5X) ：2微升。

（3）細胞核蛋白或純化的轉錄因子： 0微升。

（4）標記好的探針 ：1微升。

（5）總體積 ：10微升。

樣品反應：

（1）Nuclease-Free Water ：5微升。

（2）EMSA/Gel-Shift結合緩沖液(5X) ：2微升。

（3）細胞核蛋白或純化的轉錄因子 ：2微升。

（4）標記好的探針： 1微升。

（5）總體積： 10微升。

探針冷競爭反應：

（1）Nuclease-Free Water ：4微升。

（2）EMSA/Gel-Shift結合緩沖液(5X) ：2微升。

（3）細胞核蛋白或純化的轉錄因子： 2微升。

（4）未標記的探針： 1微升。

（5）標記好的探針： 1微升。

（6）總體積 ：10微升。

突變探針的冷競爭反應：

（1）Nuclease-Free Water ：4微升。

（2）EMSA/Gel-Shift結合緩沖液(5X) ：2微升。

（3）細胞核蛋白或純化的轉錄因子 ：2微升。

（4）未標記的突變探針： 1微升。

（5）標記好的探針： 1微升。

（6）體積 ：10微升

Super-shift反應：

（1）Nuclease-Free Water：4微升。

（2）EMSA/Gel-Shift結合緩沖液(5X) ：2微升。

（3）細胞核蛋白或純化的轉錄因子：2微升。

（4）目的蛋白特異抗體 ：1微升。

（5）標記好的探針：1微升。

（6）總體積 ：10微升。

2、加入標記好的探針前先混勻，并且室溫 （20～25 ℃） 放置 10 分鐘，從而消除可能發(fā)生的探針和蛋白的非特異性結合，或讓冷探針優(yōu)先反應。然后加入標記好的探針，混勻，室溫放置 20 分鐘。

3、加入1微升EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液(無(wú)色，10X)，混勻后立即上樣。

電泳分析：

1、用0.5XTBE作為電泳液。按照10V/厘米的電壓預電泳10分鐘。預電泳的時(shí)候如果有空余的上樣孔，可以加入少量稀釋好的1X 的EMSA上樣緩沖液(藍色)，以觀(guān)察電壓是否正常進(jìn)行。

2、把混合了上樣緩沖液的樣品加入到上樣孔內。在多余的某個(gè)上樣孔內加入10微升稀釋好的1X的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液 (藍色)，用于觀(guān)察電泳進(jìn)行的情況。

3、按照10 V/厘米的電壓電泳。確保膠的溫度不超過(guò)30℃，如果溫度升高，需要適當降低電壓。電泳至EMSA/Gel-Shift上樣緩 沖液中的藍色染料溴酚藍至膠的下緣1/4處，停止電泳。

4、剪一片大小和EMSA膠大小相近或略大的比較厚實(shí)的濾紙。小心取下夾有EMSA膠的膠板，用吸水紙或普通草紙大致擦干膠板邊 緣的電壓液。小心打開(kāi)兩塊膠板中的上面一塊(注：通常選擇先移走硅烷化的那塊玻璃板)，把濾紙從EMSA膠的一側逐漸覆蓋住整個(gè)EMSA膠，輕輕把濾紙和膠壓緊。濾紙被膠微微浸濕后(大約不足1分鐘)，輕輕揭起濾紙，這時(shí)EMSA膠會(huì )被濾紙一起揭起來(lái)。把濾紙側向下，放平，在EMSA膠的上面覆蓋一層保鮮膜，確保保鮮膜和膠之間沒(méi)有氣泡。

5、 干膠儀器上干燥EMSA膠。然后用X光片壓片檢測，或用其它適當儀器設備檢測。