一、形態(tài)學(xué)觀(guān)察方法 1、HE染色、光鏡觀(guān)察:凋亡細胞呈圓形,胞核深染,胞質(zhì)濃縮,染色質(zhì)成團塊狀,細胞表面有“出芽”現象。 2、丫啶橙(AO)染色,熒光顯微鏡觀(guān)察:活細胞核呈黃綠色熒光,胞質(zhì)呈紅色熒光。凋亡細胞核染色質(zhì)呈黃綠色濃聚在核膜內側,可見(jiàn)細胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。 3、臺盼藍染色:如果細胞膜不完整、破裂,臺盼藍染料進(jìn)入細胞,細胞變藍,即為壞死。如果細胞膜完整,細胞不為臺盼藍染色,則為正常細胞或凋亡細胞。此方法對反映細胞膜的完整性,區別壞死細胞有一定的幫助。 4、透射電鏡觀(guān)察:可見(jiàn)凋亡細胞表面微絨毛消失,核染色質(zhì)固縮、邊集,常呈新月形,核膜皺褶,胞質(zhì)緊實(shí),細胞器集中,胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細胞吞噬現象。 二、DNA凝膠電泳 ?。ㄒ唬z測原理 細胞發(fā)生凋亡或壞死,其細胞DNA均發(fā)生斷裂,細胞內小分子量DNA片斷增加,高分子DNA減少,胞質(zhì)內出現DNA片斷。但凋亡細胞DNA斷裂點(diǎn)均有規律的發(fā)生在核小體之間,出現180-200bpDNA片斷,而壞死細胞的DNA斷裂點(diǎn)為無(wú)特征的雜亂片斷,利用此特征可以確定群體細胞的死亡,并可與壞死細胞區別。 ?。ǘ┙Y果判斷 正?;罴毎鸇NA 電泳出現階梯狀(LADDER)條帶;壞死細胞DNA電泳類(lèi)似血抹片時(shí)的連續性條帶。 三、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)核小體測定 凋亡細胞的DNA斷裂使細胞質(zhì)內出現核小體。核小體由組蛋白及其伴隨的DNA片斷組成,可由ELISA法檢測。 ?。ㄒ唬z測步驟 1、將凋亡細胞裂解后高速離心,其上清液中含有核小體; 2、在微定量板上吸附組蛋白體; 3、加上清夜使抗組蛋白抗體與核小體上的組蛋白結合; 4、加辣過(guò)氧化物酶標記的抗DNA抗體使之與核小體上的DNA結合; 5、加酶的底物,測光吸收制。 ?。ǘ┯猛? 該法敏感性高,可檢測5*100/ml凋亡細胞??捎糜谌?、大鼠、小鼠的凋亡檢測。該法不需要特殊儀器,適合基層工作,但是不能精確測定凋亡細胞發(fā)生的絕多對量。 四、流式細胞儀分析 ?。ㄒ唬z測原理 細胞發(fā)生凋亡時(shí),其細胞膜的通透性也增加,但是其程度介于正常細胞與壞死細胞之間。利用一特點(diǎn),被檢測細胞懸液用熒光素染色,利用流式細胞儀測量細胞懸液中細胞熒光強度來(lái)區分正常細胞、壞死細胞核凋亡細胞。 ?。ǘ脙r(jià)值 流式細胞儀檢測具有以下特點(diǎn): 1)、檢測的細胞數量大,因此其反映群體細胞的凋亡狀態(tài)比較準確 2)、可以做許多相關(guān)性分析 3)、結合被檢測細胞的DNA含量的分析,可確定凋亡的細胞所處的細胞周期