1 AnnexinV/PI雙染色法

       磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）正常位于細胞膜的內側，但在細胞凋亡的早期，PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中。AnnexinV是一種分子量為35~36kD的Ca²⁺依賴(lài)性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力特異性結合。將AnnexinV進(jìn)行熒光素（FITC、PE）或Biotin標記，以標記了的AnnexinV作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶（propidineiodide，PI）是一種核酸染料，它不能透過(guò)完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過(guò)細胞膜而使細胞核紅染。因此將AnnexinV與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開(kāi)來(lái)。

實(shí)驗方法：

       XXX細胞直接收集到10mL的離心管中，每樣本細胞數為（1~5）×10⁶/mL， 1000r/min離心5min，棄去培養液。用孵育緩沖液洗滌1次，1000r/min離心5min。用100μL的標記溶液重懸細胞，室溫下避光孵育10~15min。1000r/min離心5min沉淀細胞孵育緩沖液洗1次。加入熒光（SA-FLOUS）溶液4℃下孵育20min，避光并不時(shí)振動(dòng)。流式細胞儀激發(fā)光波長(cháng)用488nm，用一波長(cháng)為515nm的通帶濾器檢測FITC熒光，另一波長(cháng)大于560nm的濾器檢測PI。

       結果判斷：凋亡細胞對所有用于細胞活性鑒定的染料如PI有抗染性，壞死細胞則不能。細胞膜有損傷的細胞的DNA可被PI著(zhù)染產(chǎn)生紅色熒光，而細胞膜保持完好的細胞則不會(huì )有紅色熒光產(chǎn)生。因此，在細胞凋亡的早期PI不會(huì )著(zhù)染而沒(méi)有紅色熒光信號。正?；罴毎c此相似。在雙變量流式細胞儀的散點(diǎn)圖上，左下象限顯示活細胞，為（FITC-/PI-）；右上象限是非活細胞，即壞死細胞，為（FITC+/PI+）；而右下象限為凋亡細胞，顯現（FITC+/PI-）。

2 TUNEL法

       TUNEL法也稱(chēng)DNA斷裂的原位末端標記法，這一方法能對DNA分子斷裂缺口中的3’-OH進(jìn)行原位標記，借助一種可觀(guān)測的標記物，如熒光素，能對凋亡細胞的核DNA中產(chǎn)生的3’-OH末端進(jìn)行原位標記，用熒光顯微鏡即可進(jìn)行觀(guān)察。

實(shí)驗方法：

       固定 → 透膜 → 加TUNEL反應混合物 → 加轉化劑－POD → 加底物溶液 → 觀(guān)察結果

       經(jīng)過(guò)實(shí)驗處理的細胞爬片或者細胞涂片，自然晾干，室溫固定15-30 min，PBS洗滌3次，每次5 min，加封閉液，室溫孵育10 min。PBS漂洗后加透膜液，室溫孵育30min。制備TUNEL反應混合液，處理組用50 μL TdT＋450μL熒光素標記的dUTP液混勻；而陰性對照組僅加50μL熒光素標記的dUTP液，陽(yáng)性對照組先加入100μL DNase1，反應在室溫～37℃×10～30min，后面步驟同處理組。玻片干后，加50μL TUNEL反應混合液（陰性對照組僅加50μL熒光素標記的dUTP液）于標本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應37℃×60min。PBS漂洗3次?？梢约?滴PBS在熒光顯微鏡下計數凋亡細胞（激發(fā)光波長(cháng)為450～500nm，檢測波長(cháng)為515～565nm）。玻片干后加50μl converter-POD于標本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應37℃×30min。PBS漂洗3次。在組織處加50～100μL DAB底物，反應15～25℃×10min。PBS漂洗3次。拍照后再用蘇木素或甲基綠復染，幾秒后立即用自來(lái)水沖洗。梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片。加一滴PBS或甘油在視野下，用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行計數（200～500個(gè)細胞）并拍照。

3 線(xiàn)粒體膜電位(MMP)檢測

       JC-1是一種碳氰化合物類(lèi)陽(yáng)離子熒光染料，可作為檢測線(xiàn)粒體跨膜電位指示劑。JC-1在細胞內以聚合體和單體兩種不同的物理形式存在，分別處于不同的熒光發(fā)射峰。當JC-1濃度低或膜電位水平低時(shí)，主要以單體形式存在，激發(fā)波長(cháng)為527nm，呈綠色熒光；當JC-1濃度升高或線(xiàn)粒體膜電位水平較高時(shí)，形成聚合物，發(fā)出紅色的熒光，激發(fā)波長(cháng)為590nm。當細胞發(fā)生凋亡時(shí)，線(xiàn)粒體跨膜電位被去極化，JC-1從線(xiàn)粒體內釋放，紅光強度減弱，以單體的形式存在于胞質(zhì)內發(fā)綠色熒光，根椐這一特征就可以檢測線(xiàn)粒體膜電位的變化。

實(shí)驗方法：

       用適當的方法誘導XXX細胞凋亡，收集細胞。用PBS洗滌細胞三次，收集不多于1×10⁶的細胞。取100μL 10×IncubationBuffer加900μL滅菌去離子水稀釋成1×IncubationBuffer，混勻并預熱至37℃。吸取500μL1×IncubationBuffer，加入1μLJC-1，渦旋混勻配成JC-1工作液。取500μLJC-1工作液將細胞均勻懸浮，37℃，5%CO₂的培養箱中孵育15~20min。室溫離心（2000rpm，5min）收集細胞，用1×IncubationBuffer洗兩次。吸取500μL10×IncubationBuffer重新懸浮細胞。流式細胞儀檢測，分析。