一種藥物長(cháng)期作用于某類(lèi)細胞，殺死其中沒(méi)有抗性的細胞，而對這類(lèi)細胞中具有抗性的細胞不能殺死，即進(jìn)行了選擇。具有抗性的細胞大量繁殖產(chǎn)生很多抗性后代，但再用這種藥物時(shí)表現出的藥效大大下降的現象就是細胞的耐藥性，采用體外低濃度梯度遞增聯(lián)合大劑量間斷沖擊方法誘導腫瘤細胞對特定藥物產(chǎn)生耐藥性，從而構建出對特定藥物產(chǎn)生耐藥性的腫瘤細胞株。

（一）實(shí)驗材料及試劑

培養瓶、CO₂培養箱、酒精燈、移液槍等；RPMI-1640（DMEM）胎牛血清培養液、PBS、相應作用的藥物等。

（二）實(shí)驗內容

大劑量間隙作用：對數生長(cháng)期的細胞接種于培養瓶中，生長(cháng)至 70%～80%匯合時(shí)，將處于對數生長(cháng)期的腫瘤細胞置于含有指定濃度的藥物濃度的培養液中培養，棄去培養液，PBS清洗2遍，更換不含藥物培養基，常規培養，待細胞恢復生長(cháng)，培養一段時(shí)間后更換不含藥物的RPMI-1640（DMEM）胎牛血清培養液繼續培養。待細胞穩定生長(cháng)、進(jìn)入對數生長(cháng)期后，傳代兩次，再將篩選出的細胞在指定濃度的藥物濃度培養液中繼續培養依這樣不斷改變作用時(shí)間，共經(jīng)過(guò)1h、2h、3h、6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h共10個(gè)作用時(shí)間段，約8個(gè)月的培養，最終使得細胞能夠在一定濃度的藥物的培養液中持續穩定生長(cháng)并傳代，然后脫藥培養1個(gè)月在檢測細胞的生物特性及耐藥指標。

濃度梯度遞增間隙作用：采用藥物濃度遞增培養法沖擊誘導，對數生長(cháng)期的細胞接種于培養瓶中，細胞處于 60～70%濃度對數期生長(cháng)時(shí)，加入起始濃度為低濃度的藥物作用24 h，棄去培養液，PBS清洗2遍，更換不含藥物培養基，細胞恢復生長(cháng)后，消化傳代復以低濃度作用細胞24 h，待細胞增殖至正常形態(tài)后，重復上述藥物沖擊，每種濃度沖擊 8 次。待細胞在此濃度穩定生長(cháng)后，提高藥物濃度繼續培養，藥物依次遞增濃度加藥。藥物誘導歷時(shí)大約9個(gè)月，直到細胞能夠在指定濃度的藥物中穩定生長(cháng)。