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細胞轉染

細胞轉染

   定義:轉染(transfection)指真核細胞由于外源DNA摻入而獲得新的遺傳標志的過(guò)程。常規轉染技術(shù)可分為瞬時(shí)轉染和穩定轉染(永久轉染)兩大類(lèi)


   種類(lèi):瞬時(shí)轉染的外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中,因此一個(gè)宿主細胞中可存在多個(gè)拷貝數,產(chǎn)生高水平的表達,但通常只持續幾天,多用于啟動(dòng)子和其它調控元件的分析。一般來(lái)說(shuō),超螺旋質(zhì)粒DNA轉染效率較高,在轉染后24-72小時(shí)內(依賴(lài)于各種不同的構建)分析結果,常常用到一些報告系統如熒光蛋白,β半乳糖苷酶等來(lái)幫助檢測。


   穩定轉染的外源DNA既可以整合到宿主染色體中,也可能作為一種游離體(episome)存在。盡管線(xiàn)性DNA比超螺旋DNA轉入量低但整合率高。外源DNA整合到染色體中概率很小,大約1/104轉染細胞能整合,通常需要通過(guò)一些選擇性標記,如來(lái)氨丙基轉移酶(APH;新霉素抗性基因),潮霉素B磷酸轉移酶(HPH),胸苷激酶(TK)等反復篩選,得到穩定轉染的同源細胞系。轉染技術(shù)的選擇對轉染結果影響也很大,許多轉染方法需要優(yōu)化DNA與轉染試劑比例,細胞數量,培養及檢測時(shí)間等。


外源基因進(jìn)入細胞主要有四種方法:電擊法、磷酸鈣法和脂質(zhì)體介導法和病毒介導法。 


電擊法是在細胞上短時(shí)間暫時(shí)性的穿孔讓外源質(zhì)粒進(jìn)入;


磷酸鈣法和脂質(zhì)體法是利用不同的載體物質(zhì)攜帶質(zhì)粒通過(guò)直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進(jìn)入細胞;


病毒法是利用包裝了外源基因的病毒感染細胞的方法使得其進(jìn)入細胞。但是由于電擊法和磷酸鈣法的實(shí)驗條件控制較嚴、難度較大;病毒法的前期準備較復雜、而且可能對于細胞有較大影響;


所以現在對于很多普通細胞系,一般的瞬時(shí)轉染方法多采用脂質(zhì)體法。 利用脂質(zhì)體轉染法最重要的就是防止其毒性,因此脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例,細胞密度以及轉染的時(shí)間長(cháng)短和培養基中血清的含量都是影響轉染效率的重要問(wèn)題,通過(guò)實(shí)驗摸索的合適轉染條件對于效率的提高有巨大的作用。


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