簡(jiǎn)化SSH法尋找差異表達基因
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發(fā)布時(shí)間：2016-11-29
無(wú)論是從一個(gè)胚胎細胞分化為不同的組織器官，或者是從正常的組織突變?yōu)槟[瘤組織，都可能涉及在同一基因組背景下不同基因的差異性表達。尋找差異表達的基因就有可能揭示細胞分化的機制或者腫瘤的成因，因而也就成為一項熱門(mén)的技術(shù)。
尋找差異表達的基因有不少方法，抑制消減雜交（SSH）是比較有效的一種方法。以Clontech的pcr-Select cDNA Subtraction Kit為例：將樣品（tester）和對照（driver）的mRNA分別反轉錄并合成為雙鏈cDNA后進(jìn)行酶消化；樣品（tester）分為兩組，分別加上不同的adaptor1/2；再將兩組樣品（tester）分別與過(guò)量的對照（driver）雜交，兩份雜交結果混合，加入過(guò)量的對照再進(jìn)行第二輪雜交；補齊adaptor然后用PCR選擇性擴增。由于過(guò)量的對照封閉了在樣品中共同表達的基因，而在樣品中特異表達的基因會(huì )被選擇性地擴增出來(lái)，這些擴增的片斷經(jīng)過(guò)克隆、測序后可以進(jìn)行拼接或者用RACE的方法從已知片斷釣全長(cháng)cDNA，再做進(jìn)一步的分析。
但是這一系列的操作并不簡(jiǎn)單，且得到的結果是一些基因片斷，還需要進(jìn)行下一步的拼接或RACE才能得到完整的基因信息，現在介紹一種簡(jiǎn)化的消減雜交的技術(shù)：以Miltenyi Biotec公司的μMACS mRNA Isolation Kit為例，在純化（driver）mRNA時(shí)先將組織裂解，加入耦聯(lián)了Oligo dT的磁珠懸液，混勻并立即加入放在磁場(chǎng)中的磁式分離柱中，磁珠上的Oligo dT有效吸附mRNA并懸浮在磁場(chǎng)中，其它雜質(zhì)隨溶液流出。加入新鮮的wash buffer反復淋洗干凈掛上mRNA的磁珠后，不用洗脫液洗脫mRNA，而是利用磁珠上的Oligo dT作為RT引物直接進(jìn)行反轉錄反應，再用Elution buffer洗脫mRNA，得到耦聯(lián)在磁珠上的對照單鏈cDNA庫。這時(shí)將樣品（tester）的mRNA加入磁珠中，共同表達的基因對應的mRNA被磁珠上的cDNA吸附留在磁場(chǎng)中而特異表達的mRNA不被吸附隨溶液流出柱外，這部分溶液反復過(guò)柱后得到的就是差異表達的mRNA。其它的mRNA分離試劑也可有類(lèi)似的用法，只是本文介紹的方法由于得到的mRNA純度高、完整且濃度高體積小，又是層析柱式的逐級淋洗使cDNA與mRNA吸附得更充分，所以假陽(yáng)性較少。
這種方法得到的是全長(cháng)的mRNA，可以直接得到全長(cháng)的cDNA而無(wú)需拼接DNA片斷，且操作也較為簡(jiǎn)單。至于效率或假陽(yáng)性率則因人而異了。
