實(shí)驗原理

       逆轉錄（reverse transcription）是以RNA為模板合成DNA的過(guò)程，即RNA指導下的DNA合成。此過(guò)程中，核酸合成與轉錄（DNA到RNA）過(guò)程與遺傳信息的流動(dòng)方向（RNA到DNA）相反，故稱(chēng)為逆轉錄。逆轉錄過(guò)程是RNA病毒的復制形式之一，需逆轉錄酶的催化。逆轉錄過(guò)程的揭示是分子生物學(xué)研究中的重大發(fā)現，是對中心法則的重要修正和補充。人們通過(guò)體外模擬該過(guò)程，以樣本中提取的mRNA為模板，在逆轉錄酶的作用下，合成出互補的cDNA，構建cDNA文庫，并從中篩選特異的目的基因。該方法已成為基因工程技術(shù)中最常用的獲得目的基因的策略之一。在實(shí)際工作中有助于基因工程的實(shí)施，由于目的基因的轉錄產(chǎn)物易于制備，可將mRNA反向轉錄形成DNA用以獲得目的基因。

具體操作

       將 RNA 模板、Primer Mix、dNTP Mix、DTT、5xRT Buffer、HiFiScript 和 RNase-Free Water 溶解并置于冰盒上備用。

根據以下表格配制反應體系，總體積為20ul.

       70℃孵育 10min，迅速冰浴 2min。短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。繼續向以上反應液中加入以下試劑：

         50℃孵育15min，85℃孵育 5min。反應結束后，短暫離心，置于冰上冷卻。

        逆轉錄產(chǎn)物可直接用于PCR反應和熒光定量PCR反應，加入量小于PCR反應體系的1/10,或置于-20℃長(cháng)期保存。

注意事項

       1.加入各種逆轉錄試劑及RNA時(shí)，在冰盒上操作，以防RNA降解；

       2.加入試劑后，分別進(jìn)行各階段的水浴，確保溫度、時(shí)間，已便于酶促反應完全。