大家是否在實(shí)驗中經(jīng)常遇到載體構建的各種問(wèn)題，浪費大量的時(shí)間和精力，各種各樣的問(wèn)題讓人頭疼，海創(chuàng )科業(yè)小編作為科研老司機特意為各位科研君整理了載體構建實(shí)驗常見(jiàn)問(wèn)題及解決方法，希望能夠幫助到大家。

       1. PCR

       載體構建大部分時(shí)候都要通過(guò)PCR的方法獲取目的片段，擴增PCR的時(shí)候大家盡量選用高保真的PCR酶來(lái)進(jìn)行擴增，擴增之前我們首先要了解目的基因序列信息。其次高質(zhì)量的模板對PCR成功與否也很重要，以質(zhì)粒作為模板的PCR相對來(lái)說(shuō)最好擴增，基因組DNA和cDNA相對來(lái)說(shuō)較難獲取一些。

       引物設計工作，一般很多軟件都可以進(jìn)行引物設計，例如pirmer5之類(lèi)的軟件。除了常用的酶切連接的方法也可以使用無(wú)縫克隆的方法構建，選用哪種方法我們都要在引物設計的時(shí)候考慮到，酶切連接的方法和無(wú)縫克隆引物設計注意點(diǎn)如下：

       1） 無(wú)縫克隆方法設計引物的時(shí)候要加入同源重組臂序列。

       2） 做酶切連接引物設計要注意加上保護堿基，保護堿基大部分加入4個(gè)堿基可以滿(mǎn)足大多數內切酶，也可以參照限制性?xún)惹忻副Ｗo堿基添加表加保護堿基。

       在擴增前我們應了解目的片段是否有高GC、或者重復序列之類(lèi)的特殊序列，還有片段長(cháng)度都會(huì )影響實(shí)驗，不推薦一次構建片段5K以上的實(shí)驗，如果片段過(guò)長(cháng)我們可以通過(guò)拆分目的片段來(lái)分步構建，一定要注意要設計好之前的用到的內切酶位點(diǎn)的設計，片段長(cháng)度的增加與實(shí)驗難度是成正比的，如果你的目的片段含有高GC序列，可以加入DMSO之類(lèi)的輔助劑增加PCR的擴增效率，現在市面上針對高GC等特殊結構的PCR酶也很多，大家也可以用此類(lèi)的酶擴增，擴增好PCR要進(jìn)行純化回收，此步不多講，一般膠回收試劑盒都能滿(mǎn)足要求。

       2. 線(xiàn)性化所用載體

       很多人習慣先構建到T載體再進(jìn)行下一步的構建，其實(shí)基本直接構建到最終載體成功率也非常高，以下一些注意事項希望能幫大家節省時(shí)間直接省略T載體構建一步成功。

線(xiàn)性化載體的時(shí)候，最好驗證過(guò)載體是沒(méi)有問(wèn)題的，通常我們單酶切或雙酶切的時(shí)候要注意內切酶的buffer是否沒(méi)有用錯，一般根據說(shuō)明書(shū)再延長(cháng)一些時(shí)間會(huì )使線(xiàn)性化更加徹底，增加載體構建的陽(yáng)性率，

       3. 連接反應

       一般載體與目的片段的比例推薦1:1到1:4，使用nanodrop進(jìn)行定量，通常根據紫外燈通過(guò)亮度對比也是可以的，連接反應的時(shí)候最好在冰上操作，此步要操作輕柔，載體和片段連接酶之類(lèi)的加入要混勻，PCR上機反應

       4. 轉化

       轉化實(shí)驗要保證感受態(tài)細胞的轉化效率，通常實(shí)驗要求轉化之后要加入培養基進(jìn)行復蘇，海創(chuàng )科業(yè)小編大量經(jīng)驗驗證可以不必復蘇，直接涂板，無(wú)論是amp抑菌類(lèi)的抗生素或者kana殺菌類(lèi)的抗生素都是可以直接涂板的。涂板之后37℃過(guò)夜培養即可。

       5. 菌落PCR鑒定

       做菌落PCR鑒定的時(shí)候引物一般選擇載體上的通用引物來(lái)鑒定，因為選用目的片段兩端的引物可能會(huì )出現假陽(yáng)性；操作方法一般挑取單克隆在小的EP管培養4小時(shí)左右，培養基出現渾濁的情況即可以進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定完成后一般送三四個(gè)送測序驗證即可，pcr過(guò)程可能會(huì )發(fā)生突變，所以多送幾個(gè)克隆可以保證我們所要的克隆順利獲得。

       （本文轉載丁香通）