一、實(shí)驗目的與原理

質(zhì)粒多為一些雙鏈、環(huán)狀的DNA分子，是獨立于細菌染色體之外進(jìn)行復制和遺傳的輔助性遺傳單位。質(zhì)粒是進(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)驗操作，進(jìn)行遺傳工程改良物種等工作時(shí)最主要的DNA載體。

提取質(zhì)粒的基本步驟分為三步：

①細菌的培養和質(zhì)粒的擴增

②細菌菌體的裂解

③質(zhì)粒DNA的純化

本實(shí)驗采取的菌體裂解方法為堿解法，質(zhì)粒純化方法為梯度離心法。

二、材料與試劑

1、材料：大腸桿菌

2、儀器：超凈工作臺，培養箱，搖床，恒溫水浴鍋，臺式離心機，取液器一套，低溫冰箱，冷凍真空干燥機，電泳儀，水平電泳槽，紫外觀(guān)測儀

3、試劑：

Solution I 25 mM Tris-Hcl(pH7.4)

10 mM EDTA(pH8.0)

50 mM葡萄糖

高壓滅菌，4℃保存

Solution II 0.2 M NaOH, 1%SDS 現配現用

Solution III 5 N KAc pH4.8

高壓滅菌，4℃保存

3 M NaAc PH5.2, 高壓滅菌，4℃保存。異丙醇，溶菌酶（8 mg/ml），酚/氯仿，無(wú)水乙醇，70％乙醇，LB培養基，電泳試劑

三、操作步驟

1、細菌繁殖

LB培養基，2 ml/20ml，37℃，200rpm，搖一搖，過(guò)夜

2、離心10 min，5000 rpm, 4℃；棄上淸液

3、沉淀（菌體細胞）預冷的TES緩沖液洗滌，離心10 min，5000 rpm, 4℃

加入預冷的1 ml Solution I，冰浴，10 min

4、重新懸浮，加入150 ul溶菌酶母液，室溫放置5 min

5、加入1.2 ml Solution II, 冰浴，5 min

6、加入0.9 ml預冷乙酸鉀，混勻，離心10 min，12000 rpm, 4℃

7、加入1.5 ml異丙醇，-20℃冰箱內放置15 min

8、離心10 min，12000 rpm, 4℃

9、取沉淀，懸于400 ul TE緩沖液中

10、加入40 ul，3 M NaAc

11、酚/氯仿，抽提，乙醇沉淀

12、離心10 min，12000 rpm, 4℃

13、取沉淀，冷凍干燥，再懸浮于50 ul TE緩沖液中。

14、電泳檢測提取DNA的質(zhì)量

四、結果與分析

超螺旋結構DNA

此文轉載來(lái)源：丁香通