FISH（熒光原位雜交）技術(shù)我們常應用于 mRNA、miRNA 及 lncRNA 等表達及定位分析，步驟不算復雜，但想做出一張漂亮的片子也不是很容易，那么在FISH實(shí)驗中都有哪些套路？現在中洪君就和大家分享一下，希望給你帶來(lái)一些幫助！

（請耐心花2分鐘閱讀完本文，建議推薦給小伙伴一起學(xué)）

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FISH實(shí)驗原理

熒光原位雜交(Fluorescence In Situ Hybridization，FISH)是20世紀80年代初在放射性原位雜交技術(shù)的基礎上發(fā)展起來(lái)的一種非放射性原位雜交技術(shù)。其基本原理是以熒光素標記的單鏈核酸為探針，根據堿基互補配對原則,經(jīng)過(guò)共變性—退火—復性的過(guò)程使探針與樣本DNA的互補區域雜交，與傳統的放射性標記原位雜交相比，熒光原位雜交具有快速、檢測信號強、雜交特異性高和實(shí)現多重染色等特點(diǎn)。

（熒光實(shí)拍圖，請勿盜用）

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實(shí)驗流程

FISH樣本的制備→探針的制備→探針標記→雜交→染色體顯帶→熒光顯微鏡檢測→結果分析。 

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實(shí)驗步驟（甲酰胺法）

▲  玻片準備： 

將已收獲的標本滴在玻片上，在顯微 鏡下觀(guān)察滴片質(zhì)量并標記雜交區域。

理想的標本 質(zhì)量為：細胞分布均勻不重疊，密度適中，胞漿 含量少。將玻片放入已37℃水浴預溫的 2×SSC 溶液中，老化30 min。70％ 、85％ 、100％ 的乙 醇中室溫下梯度脫水各2到3分鐘，室溫下晾干。

玻片DNA變性：

將玻片放入已在73±1℃  水浴中預熱的70%甲酰胺/2×SSC混合液  中，每缸≤4張玻片變性3～5min，取出分別在70%、80%、100%冰乙醇缸中脫水各2分鐘而使變性終止。玻片室溫下晾干。   

▲ 探針變性： 

①探針準備（按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)配制不同探針） 

例：LSI BCR/ABL雙標雙融合易位探針準備如下：

a. 雜交液（buffer）   7μl 

b. H2O                      2μl 

c. 探針                       1μl 

d. 加入到0.5ml離心管中混勻，離心1～3秒。 

②將裝有探針的離心管放入73±1℃水浴箱中，變 性處理5分鐘，移至37℃水浴箱中預雜交5min。 

▲ 雜交：將10μl探針加在玻片上已劃定的雜  交區域內，用22×22mm蓋玻片蓋好，注意  避免氣泡的出現，再用封片膠封好四周，略干后放入保濕盒內，在37℃恒溫箱中雜  交16～18h。   

▲洗滌：

①將3缸50%甲酰胺/2×SSC溶液中，2缸 2×SSC置46±1℃水浴箱中預溫30 min。

②將雜交后的玻片去除蓋玻片依次放入已 46±1℃預溫的1、2、3號50%甲酰胺/2×SSC 溶液缸中，每缸≤4張玻片，洗滌各10 min。

③將玻片轉至已46±1℃預溫的2×SSC溶液 中，洗滌各5 min。 

▲ 復染：每個(gè)雜交區域加DAPIⅡ10μl，蓋玻 片封片，室溫中復染15分鐘。  

▲ 鏡檢：每張片隨機分析計數200～1000個(gè)間 期核，并記錄雜交信號。

▲雜交儀法

玻片準備：同甲酰胺程序的玻片處理

探針準備：同甲酰胺程序

雜交：    

①將10μl探針混合液加在玻片上劃定的雜交區域 內，用22×22mm蓋玻片蓋好，封片膠封片，將 玻片放入雜交儀或恒溫熱平臺上。  

②雜交儀設置：變性溫度72-75℃，時(shí)間2～5min， 雜交溫度37℃，時(shí)間16～18h 

洗滌：同甲酰胺程序

復染：同甲酰胺程序

鏡檢：同甲酰胺程序

▲快速BM涂片 

1）標本處理：骨髓涂片放入3:1 甲醇冰醋酸固定液中5-10 分鐘；2×SSC溶液兩缸各浸泡5分鐘  ? 70％ 、85％ 、100％ 的乙醇中室溫下梯度 脫水各2到3分鐘，室溫下晾干 暗視野下選取雜交區域，其余步驟同雜交儀法。

（石蠟切片實(shí)拍圖）

2）石蠟切片FISH 

組織切片的制備、脫蠟和水化 

①制備 切片機切下厚度為4-5um組織，37℃水浴展 片，貼于玻片上，晾干，56 ℃烤過(guò)夜。 

②脫蠟 用鉆石筆標出雜交區域，將切片浸入二甲 苯中,10分鐘×2次，室溫用100％的無(wú)水乙醇脫水， 5分鐘×2次 

③水化 將玻片依次浸入室溫100%、85%、70% 乙醇各2分鐘水化。

3）增強組織通透性處理

①將蒸餾水和2ml EDTA加入壓力鍋燒沸

②將玻片置入沸水中，加熱至噴汽

③轉入蒸餾水中2分鐘  

4）蛋白酶處理 

①將蛋白酶預溫至37 ℃，切片浸入20分鐘

②轉入蒸餾水中1分鐘，再依次脫水

③室溫風(fēng)干  

5）FISH雜交、洗滌、觀(guān)察同“雜交儀法”  

膀胱癌脫落細胞FISH

收集晨尿，離心，收集細胞沉淀。

低滲、預固定和固定同“染色體制備”。

FISH操作步驟同“雜交儀法”。

鏡檢注意：選擇DAPI下染色不均一、核大、橢 圓的脫落細胞觀(guān)察，排除炎癥細胞。

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注意事項

FISH對檢測的條件要求很高。檢測過(guò)程中的溫度、試劑的酸堿度，反應的時(shí)間都會(huì )對結果產(chǎn)生影響。因此在操作中應注意：

1）雜交前樣本的老化相當重要，尤其是胃蛋白酶的濃度、消化的時(shí)間掌握不好，直接影響雜交的效果。若消化過(guò)度，細胞出現“鬼影”或整個(gè)組織消失成為廢片；若消化不足，則顯示持續的自發(fā)熒光或者差的DAPI染色；

2）操作過(guò)程中的溫度控制應嚴格按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，而且在反應前把液體預溫到所要求的溫度，檢測中所使用的設備例如蓋玻片、載玻片都應注意預熱；

3）各步驟時(shí)間應準確，每次操作都要迅速；

4）為防止淬滅，雜交后的洗脫和晾干要注意避光?？梢约尤肟勾銣鐒?；

5） 此種片在-20℃避光保存1周。若要長(cháng)期保存，應加入抗淬滅劑。