一. 實(shí)驗原理及背景

原位雜交可分為菌落原位雜交和組織原位雜交。

菌落原位雜交是將細菌從培養平板轉移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂解以釋放DNA。將DNA烘干固定于膜上，然后將濾膜上的菌落裂菌以釋放出DNA。將DNA烘干固定于膜上與32P標記的探針雜交，放射自顯影檢測菌落雜交信號，并與平板上的菌落對位。

組織原位雜交簡(jiǎn)稱(chēng)原位雜交，指組織或細胞的原位雜交，它與菌落的原位雜交不同。菌落原位雜交需要裂解細菌釋放DNA，然后進(jìn)行雜交。而原位雜交是經(jīng)適當處理后，使細胞通透性增加，讓探針進(jìn)入細胞內與DNA或RNA雜交。

二. 具體步驟

1、將加入探針的雜交液先于50℃預熱，均勻涂于切片表面，加上硅化蓋玻片，放于濕盒中，50℃孵育12-16h。

2、1×SSC（含50%甲酰胺），50℃洗滌2次，每次10min。

3、2×SSC（含50%甲酰胺），37℃洗滌10min。

4、2×SSC（0.5ug/ml RNaseA），37℃洗滌30min。

5、1×SSC，50℃洗滌10min。

6、1×PBS（含0.1%Tween20），50℃洗滌2次，每次10min。

7、PBT室溫洗滌10min。

8、封閉液處理1-1.5h。

9、加抗體（用封閉劑按1:500比例稀釋?zhuān)?，均勻地涂于切片表面，放于濕盒中，室?-2h后4℃過(guò)夜（抗體1:500稀釋于1×封閉液）。

10、PBT洗滌3次，每次15min。

11、顯色緩沖液洗5min。

12、滴加顯色液，黑暗中顯色至適度?？稍陲@微鏡下多次觀(guān)察。

13、顯色終止液洗10min，雙蒸水洗5次。

14、甲基綠（0.25%）滴加染色幾秒中，雙真水洗5min。

15、脫水封片。

三、注意事項

1、 原位雜交固定的目的是為了保持細胞結構，最大限度地保存細胞內DNA或RNA的水平，使探針易于進(jìn)入細胞或組織。DNA較穩定，RNA易被酶解，在RNA定位上，若要使RNA的降解減少到最低限度，取材后應盡快予以冷凍或固定。

2、 玻片包括蓋片和載玻片用熱肥皂水刷洗，自來(lái)水清洗干凈后，置于清潔液中浸泡24h，清水洗凈烘干，95%乙醇中浸泡24h后蒸餾水沖洗、烘干，烘箱溫度最好在150℃或以上過(guò)夜除去所有RNA酶。蓋玻片在有條件時(shí)最好用硅化處理，錫箔紙包裹無(wú)塵存放。

3、 由于在手指皮膚及實(shí)驗玻璃皿上均可能有RNA酶，為防止其污染影響實(shí)驗結果，在整個(gè)雜交前一日置高溫（240℃）烘烤以達到消除RNA酶的目的。要破壞RNA酶，其最低溫度必須在150℃左右。

4、 整個(gè)實(shí)驗過(guò)程中，切勿切片干燥，否則會(huì )嚴重影響實(shí)驗結果。

四、部分試劑配置

1、 0.1mol/L三乙醇胺-0.25%乙酸酐：三乙醇胺13.2ml，氯化鈉5g，濃鹽酸4ml，DEPC水定容至約1000ml，臨用前，一邊搖動(dòng)溶液一邊加入乙酸酐2.5ml，充分混合。

2、 10×PBS：氯化鈉 80g，Na2HPO4·12H2O2 32.3g，NaH2PO4·2H2O2 4.5g。加DEPC水900ml，用HCl/NaOH調pH至7.2，最后定容為1000ml。

3、 20×SSC（pH=7.0）：氯化鈉175.3g，枸櫞酸鈉88.2g，DEPC水（ddH2O）定容至1L。

4、 100×Denhardts：Ficoll1g，PVP1g，BSA1g，DEPC水定容至50mL。

5、 預雜交液：2×SSC，50%甲酰胺，100ug/ml變性魚(yú)精DNA，5×Denhardts。

6、 雜交液：2×SSC，50%甲酰胺,1×Denhardts,250μg/mL酵母tRNA或100μg/mL變性魚(yú)精DNA,10mmol/L Tris-HC1 (pH7.5)，0.5％SDS，5％葡聚糖硫酸酯，標記探針。

7、 PBT：1×PBS，0.1％Triton×100，2mg/mL BSA使用前加入。

8、 封閉液：0.1mol/L Tris-HCI pH7.5，0.15mol/L NaCI，0.5％羊血清或2％BSA。

9、 顯色緩沖液：100mmol/L Tris-HCI pH9.5，100mmol/L NaCI，50mmol/L MgCl2。

10、 顯色液：4.5μL/mL NBT，3.5μL/mL BCIP，用顯色緩沖液配制。

11、 顯色終止液：0.1mol/L Tris-HCl pH8.0，10mmol/L EDTA。