制備動(dòng)物模型的基因修飾技術(shù)
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發(fā)布時(shí)間：2017-09-06
動(dòng)物模型是現代生命科學(xué)研究的重要工具，特別是基因工程小鼠和大鼠，在基因功能研究、人類(lèi)生理病理機制研究及新藥研發(fā)中起著(zhù)不可替代的作用。近幾年來(lái)，制備動(dòng)物模型的基因修飾技術(shù)層出不窮，這不僅包括傳統ES打靶、TALEN、CRISPR/Cas9，還有TetraOneTM 基因敲除新技術(shù)。我們將對這四種技術(shù)的原理、特點(diǎn)、缺陷、未來(lái)發(fā)展趨勢作系統的介紹和對比，供您的科研選擇參考。
1、傳統ES打靶基因敲除：技術(shù)成熟、修飾準確、效果穩定，但制作周期長(cháng)達一年
基于胚胎干細胞的同源重組技術(shù)俗稱(chēng)“傳統的基因打靶技術(shù)”。因具有技術(shù)成熟、修飾準確、效果穩定等優(yōu)點(diǎn)而受到眾多科學(xué)家一致好評，此外，世界上所有重要的的小鼠動(dòng)物模型均通過(guò)此技術(shù)制備。盡管新興核酸酶敲除技術(shù)如ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等相繼出現，但基于胚胎干細胞的同源重組技術(shù)依然是唯一可以滿(mǎn)足所有基因組修飾要求的技術(shù)。
基因打靶就是通過(guò)同源重組技術(shù)將外源基因定點(diǎn)整合進(jìn)靶細胞基因組上某一確定的位點(diǎn)，以達到定點(diǎn)修飾改造染色體上某一基因的目的?；虼虬屑夹g(shù)目前已被廣泛認為是一種理想的特定修飾與改造生物體遺傳物質(zhì)的最佳方法，其中包括了多種不同的基因敲除和敲入系統，特別是條件性和誘導性基因打靶系統的建立，使得對基因在時(shí)間和空間上的靶位修飾更加明確、效果更加精確可靠。
2、TALEN基因敲除：周期短，但存在馬賽克現象和脫靶現象
TALEN 技術(shù)是一種新的分子生物學(xué)工具?？茖W(xué)家發(fā)現，來(lái)自一種植物細菌的TAL蛋白的核酸結合域的氨基酸序列與其靶位點(diǎn)的核酸序列有恒定的對應關(guān)系。利用TAL的序列模塊，可組裝成特異結合任意DNA序列的模塊化蛋白，從而達到靶向操作內源性基因的目的，它克服了ZFN方法不能識別任意目標基因序列，以及識別序列經(jīng)常受上下游序列影響等問(wèn)題，且具有ZFN相等或更好的靈活性，使基因操作變得更加簡(jiǎn)單方便。但因為脫靶的問(wèn)題，利用TALEN技術(shù)進(jìn)行小鼠的基因修飾仍然無(wú)法取代傳統技術(shù)。加上存在馬賽克現象，所以在做基因敲入（KI）和其他應用時(shí)候也必須謹慎的進(jìn)行檢測。
3、CRISPR/Cas9基因敲除：周期短，但存在馬賽克現象和脫靶現象
CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是最新出現的一種由RNA指導Cas核酸酶對靶向基因進(jìn)行特定DNA修飾的技術(shù)。 CRISPR 是細菌和古細菌為應對病毒和質(zhì)粒不斷攻擊而演化來(lái)的獲得性免疫防御機制。在這一系統中，crRNA（CRISPR-derived RNA）通過(guò)堿基配對與tracrRNA（trans-activating RNA）結合形成雙鏈RNA，此tracrRNA/crRNA二元復合體指導Cas9蛋白在crRNA引導序列靶定位點(diǎn)剪切雙鏈DNA達到對基因組DNA進(jìn)行修飾的目的。CRISPR/Cas9系統能夠對小鼠和大鼠基因組特定基因位點(diǎn)進(jìn)行精確編輯， 目前已經(jīng)成功應用于大小鼠基因的KO/KI模型制備，其原理也是對目的片段產(chǎn)生特異的切割后，修復過(guò)程中產(chǎn)生移碼突變或者是片段缺失，或者是在切開(kāi)位置產(chǎn)生片段插入等現象。
4、 TetraOneTM基因敲除：技術(shù)成熟、修飾準確、效果穩定，制作周期只需6個(gè)月
TetraOneTM基因敲除是業(yè)界推出的新技術(shù)，沿用胚胎干細胞同源重組的技術(shù)體系，采用獨特的建系和基因改造技術(shù)建立了具有遺傳優(yōu)勢的TetraOneTMES細胞系，通過(guò)胚胎發(fā)育前期的顯微注射，使TetraOneTMES細胞100%代替內源ES細胞，實(shí)現跨越“嵌合體”階段從而快速獲得去Neo雜合子小鼠的基因打靶專(zhuān)利技術(shù)。
TetraOneTM 技術(shù)是基于胚胎干細胞技術(shù)的金標準，通過(guò)同源重組技術(shù)將外源基因定點(diǎn)整合進(jìn)靶細胞基因組上某一確定的位點(diǎn)，以達到定點(diǎn)修飾改造基因組某一基因的目的。同時(shí)TetraOneTM 技術(shù)還具有核酸酶技術(shù)周期短的優(yōu)勢，將傳統ES打靶技術(shù)的周期縮短一半，并且不會(huì )像核酸酶技術(shù)一樣帶來(lái)脫靶效應和馬賽克現象，在核酸酶技術(shù)沒(méi)有成熟之前，TetraOneTM技術(shù)將是研究者最佳的選擇。
（本文轉載丁香通）
