實(shí)驗方法原理    

      GTC和N-十二烷基肌氨酸鈉的聯(lián)合使用，將促使核蛋白復合體的解離，使RNA 與蛋白質(zhì)分離，并將RNA 釋放到溶液中。而進(jìn)一步從復合體中純化RNA ，則根據Chomc zynski和Sacchi的一步快速抽提法進(jìn)行，采用酸性酚-氯仿混合液抽提。低pH值的酚將使RNA 進(jìn)入水相，這樣使其與仍留在有機相中的蛋白質(zhì)和DNA分離。水相中的RNA 可用異丙醇沉淀濃縮。進(jìn)一步將上述RNA 沉淀復溶于GTC溶液中，接著(zhù)用異丙醇進(jìn)行二次沉淀，隨后用乙醇洗滌沉淀，即可去除所有殘留的蛋白質(zhì)和無(wú)機鹽，而RNA 中如含無(wú)機鹽，則有可能對以后操作中的一些酶促反應產(chǎn)生抑制。

實(shí)驗材料  微生物動(dòng)物細胞植物組織

試劑、試劑盒 RNA  提取試劑盒焦碳酸二乙酯乙醇

儀器、耗材  恒溫水浴冷凍高速離心機紫外分光光度計取液器電泳儀電泳槽

實(shí)驗步驟

一、細胞或組織破碎

 

1.  微生物材料

 

      （1）發(fā)酵3~4天（或對數生長(cháng)期）的菌體，離心收集菌絲體（動(dòng)植物材料無(wú)需此步處理）。

 

      （2）用經(jīng)DEPC處理的水洗菌絲體2~3次，并盡量除去殘存的水。

 

      （3）加液氮充分研磨，使其成為粉末，以釋放RNA。

 

      （4）研磨后的樣品轉移至12 ml 變性液的容器中勻漿。

 

2.  動(dòng)植物細胞培養材料 （適用的樣品量為細胞：108）

 

      （1）細胞或組織培養：按常規方法進(jìn)行。

 

      （2）深層懸浮培養細胞的破碎。

 

      ①細胞收集：含一定濃度的細胞培養液置于無(wú)菌離心管中，4℃，3 000 g 離心5分鐘。

 

      ②細胞洗滌：上步沉淀用25 ml 滅菌后冰凍的1×PBS緩沖液洗滌，然后4℃，3 000 g 離心5分鐘。

 

      ③細胞破碎：在沉淀細胞中加入15 ml 預冷的變性液，用無(wú)菌處理過(guò)的勻漿器勻漿。

 

3.  表面培養細胞的破碎

 

      （1）確定培養瓶數量，使選定的各培養瓶細胞累加后總量達108。

 

      （2）細胞收集：將培養液倒掉，用預冷的無(wú)菌PBS緩沖液洗滌一次，在培養瓶中加入8 ml 預冷變性液。

 

      （3）轉動(dòng)培養瓶，使細胞溶解，此時(shí)可見(jiàn)粘度加大。

 

      （4）用無(wú)菌吸管將第一個(gè)培養瓶中的液體吸入第二個(gè)培養瓶，旋轉，溶解細胞，再吸入第三個(gè)培養瓶，以此類(lèi)推。

 

      （5）直到將所選定的培養瓶全部洗滌一次，然后從第一個(gè)培養瓶開(kāi)始再加入4毫升上述變性液，將所有培養瓶洗一次。

 

      （6）將上述12 ml 含細胞的變性液轉移至一50 ml 無(wú)菌離心管中，勻漿破碎細胞。

 

4.  植物組織破碎 （適用的樣品量為0.05 g 組織）

 

      （1）將600 ul 變性液置于1.5 ml 離心管中，將此離心管放于冰浴中5分鐘。

 

      （2）將0.05 g 新鮮組織用液氮冰凍。

 

      （3）在液氮下，研磨組織塊。

 

      （4）待液氮揮發(fā)后，將上述分散的組織轉移至無(wú)菌離心管中。

 

5.  動(dòng)物組織破碎 （適用的樣品量為1 g 組織）

 

      （1）將12 ml 變性液置于50 ml 離心管中，將此離心管放于冰浴中5分鐘。

 

      （2）在上述管中加入1 g 新鮮或冰凍動(dòng)物組織，勻漿粉碎。

 

二、RNA 的抽提

 

      1.  在經(jīng)變性液勻漿的細胞或組織600 ul+60 ul pH4.0的2 M 乙酸鈉徹底混勻，可用漩渦振蕩器。

 

      2.  600 ul 酚\氯仿\異戊醇（25\24\1），徹底混勻或漩渦振蕩器振蕩10秒。

 

      3.  冰裕中10~15分鐘，離心，4℃，10 000 g，20分鐘。

 

      4.  上層水相吸至無(wú)菌離心管中加等體積的異丙醇，-70℃，30分鐘沉淀RNA。

 

      5.  離心4℃，10 000 g，20分鐘。

 

      6.  沉淀RNA ，冷凍干燥15分鐘 ， RNA 沉淀重新溶于300 ul 變性液中，可振蕩（有時(shí)為了幫助溶解，可在65℃加熱，但時(shí)間應極短）。

 

      7.  60 ul pH4.0的2 M 乙酸鈉徹底混勻，可用漩渦振蕩器。

 

      8.  600 ul 酚\氯仿\異戊醇（25\24\1），徹底混勻或漩渦振蕩器振蕩10秒。

 

      9.  冰裕中10~15分鐘，離心，4℃，10 000 g，20分鐘。

 

      10.  上層水相吸至無(wú)菌離心管中。

 

      11.  等體積異丙醇二次沉淀（-70℃，30分鐘），75%乙醇洗沉淀，沉淀冷凍干燥。

 

      12.  復溶于去RNA 酶的水中（對于準備長(cháng)期保存的RNA 可加入pH 5.0的乙酸鈉至終濃度為0.25 M，再加入2.5體積的乙醇，-70℃保存。）。

  （本文轉載丁香園）