1)技術(shù)原理:

RNA干擾（RNA interfering，RNAi）現象是由與靶基因序列同源的雙鏈RNA引發(fā)的廣泛存在于生物體內的序列特異性基因轉錄后的沉默過(guò)程。由于RNAi具有高度的序列專(zhuān)一性和有效的干擾，可以特異地將基因沉默，從而使基因功能喪失或基因表達量的降低，因此可以作為功能基因組學(xué)的一種強有力的研究工具。

RNAi技術(shù)可廣泛應用到包括功能學(xué)，藥物靶點(diǎn)篩選，細胞信號傳導通路分析，疾病治療等領(lǐng)域。我們應用專(zhuān)利算法和Invitrogen的BLOCK-iT? RNAi Designer平臺，可對靶基因序列進(jìn)行干擾位置效應評價(jià)和序列同源性分析，完成siRNA/shRNA/miRNA等多種序列的設計，并提供從siRNA合成、RNAi載體構建到RNAi相關(guān)的病毒包裝、RNAi功能驗證等全面的RNAi解決方案。

RNAi服務(wù)類(lèi)別：

a. siRNA合成

對于瞬時(shí)基因沉默試驗，化學(xué)合成siRNA的方法操作簡(jiǎn)便，容易獲得高水平的瞬時(shí)沉默效果，特異性強。我們通過(guò)嚴格設計來(lái)增強siRNA的專(zhuān)一性；針對某靶基因設計的3條siRNA可保證其中兩條的Knockdown效率達到70%（在轉染效率大于80%的情況下）。

b.  RNAi載體構建

RNAi載體表達可以長(cháng)時(shí)間穩定地研究基因功能，載體在細胞中持續抑制靶基因的表達可達數星期甚至更久。

BLOCK-iT? miR RNAi載體構建－利用細胞內源性的miRNA加工機制，相比傳統shRNA載體可更高效地表達RNA發(fā)夾結構，并具有采用EmGFP進(jìn)行表達追蹤和順式表達多個(gè)miRNA的優(yōu)點(diǎn)。Invitrogen針對人類(lèi)、大鼠、小鼠的大多數基因預先設計好了BLOCK-iT miR RNAi Select序列，每個(gè)基因設計的4條BLOCK-iT miR RNAi Select序列我們保證至少有2條可以達到至少70%轉錄水平的knockdown（在轉染效率>80%的前提下）。

BLOCK-iT? shRNA載體構建—設計針對特定基因的shRNA序列，并將其連入組成型pENTR?/U6或誘導型pENTR?/H1/TO載體中。

c. RNAi導入優(yōu)化

由于siRNAs是進(jìn)入細胞后才能對蛋白的表達進(jìn)行抑制，因此如何高效地將siRNAs轉入細胞也是成功抑制基因表達的關(guān)鍵步驟。例如，一個(gè)siRNA分子對某特定基因的抑制效率為90%，而轉染效率為10%，那么最后抑制蛋白表達最后的效率只有9%，可見(jiàn)如何提高siRNAs的導入效率非常重要。

RNAi轉染優(yōu)化－為了使得RNAi實(shí)驗獲得最大化的干擾效果，利用Invitrogen專(zhuān)利的脂質(zhì)體轉染試劑技術(shù)，針對多種真核生物細胞進(jìn)行轉染參數的優(yōu)化。RNAi 熒光標記的陰性對照、陽(yáng)性對照可以用于進(jìn)行轉染效率的優(yōu)化。

病毒侵染優(yōu)化－針對難于轉染細胞（特別是神經(jīng)細胞、懸浮細胞、干細胞）和In vivo實(shí)驗，基于Invitrogen的RNAi病毒載體構建、包裝、濃縮等技術(shù)，利用腺病毒或慢病毒進(jìn)行RNAi研究

篩選RNAi穩定細胞株－利用抗生素來(lái)篩選穩定表達shRNA或miRNA的細胞株

d. RNAi干擾效果檢測

用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測mRNA水平的基因敲減效果；通過(guò)Western blot方法檢測蛋白水平的基因敲減效果

2）特點(diǎn)：

高效性：

Elbashir等在研究中發(fā)現分別為25 nmol/L與100 nmol/L的起始雙鏈RNA產(chǎn)生的結果是一樣的，只是高濃度起始的更有效些。將雙鏈RNA濃度降低到1.5 nmol/L時(shí)產(chǎn)生的基因沉默效果變化不大，只有當濃度降低到0.05 nmol/L時(shí)，沉默的效果才消失。Holen等也證實(shí)1～100 nmol/L的雙鏈RNA濃度對基因沉默的效果是一致的。這說(shuō)明雙鏈RNA介導的基因沉默效率是相當高的。需要ATP：Zamore等認為RNAi過(guò)程中至少有2個(gè)步驟需要能量的供給：一是長(cháng)的雙鏈RNA被 Dicer所酶切產(chǎn)生雙鏈RNA；二是在雙鏈RNA與RISC結合解鏈后形成有活性的RISC。

特異性：

Elbashir等和Brummel kamp等發(fā)現在21～23個(gè)堿基對中有1～2個(gè)堿基錯配會(huì )大大降低對靶mRNA的降解效果。

位置效應：

Holen等根據人TF(tissue factor）不同的位置各合成了4組雙鏈RNA來(lái)檢測不同位置的雙鏈RNA對基因沉默效率的影響。在不同濃度和不同類(lèi)型的細胞中，hTF167i和hTF372i能夠抑制85%～90%的基因活性，hTF562i只能抑制部分基因活性，而hTF478i則幾乎沒(méi)有抑制基因的活性。他們還以hTF167為中心依次相差3個(gè)堿基對在其左右各合成了幾組雙鏈RNA，有趣的是它們所能抑制該基因活性的能力以hTF167為中心依次遞減。特別是hTF158i和 hTF161i只與hTF167i相距9個(gè)和6個(gè)堿基，但它們幾乎沒(méi)有抑制該基因活性的能力。結果還表明雙鏈RNA對mRNA的結合部位有堿基偏好性，相對而言，GC含量較低的mRNA被沉默效果較好。

競爭效應：

Hoten等將10 nmol/L和30 nmol/L的hTF167i相比，兩者的沉默基因效果無(wú)差異，但將20 nmol/L基因抑制效果很差的PSK314i和10 nmol/L的hTF167i相混和后，hTF167i產(chǎn)生的抑制效果明顯降低。

可傳播性：

在線(xiàn)蟲(chóng)中，雙鏈RNA可以從起始位置傳播到遠的地方，甚至于全身。Feinberg 和Hunter在線(xiàn)蟲(chóng)細胞膜上發(fā)現一種跨膜蛋白SID1，它可以將雙鏈RNA轉運出細胞，因此系統性的RNAi包括了SID1介導的雙鏈 RNA在細胞間的運輸。但在果蠅上并未發(fā)現有此基因的同源物，因此在果蠅上通過(guò)注射產(chǎn)生的RNAi不能擴散。

（本文轉載丁香通）