1) 取10μl待測DNA，于一定濃度的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。(20mL，1.0%凝膠)

2) 凝膠用溴化乙錠染色，切掉凝膠四周多余部分，并在凝膠的一角作一記號， 拍照記錄電泳結果(拍照時(shí)， 凝膠旁放一尺子)。

3) 雜交用膠的制備 (做以下步驟兩組合一)

A. 將凝膠浸沒(méi)入30mL 0.25mol/L HCl溶液中15min，使DNA脫嘌呤。

B.用蒸餾水短暫洗凝膠2次。

C.將凝膠浸沒(méi)入30mL變性液中30min， 使凝膠變性。

D.將凝膠浸沒(méi)入30mL中和液中15min使它被中和。重復D一次。在制備雜交用膠時(shí)準備轉移的平臺、膜、濾紙等(4、5)。

4) 準備DNA從凝膠向膜轉移的平臺

5) 將1張待用尼龍膜和3張厚濾紙切成與待轉移膠相同大小，并在尼龍膜一角做一標記。另1張厚濾紙切成與凝膠相同寬度，長(cháng)度(約18cm)足以達到轉移液盒子的底部。準備10 X SSC 轉移液。將待用尼龍膜用蒸餾水浸濕后，再浸入10 X SSC 轉移液中。

6）安裝毛細管轉移裝置

A.將長(cháng)的濾紙放在轉移平臺的頂部，濾紙兩端達到轉移盒的底部，做成虹吸橋。

B.將8 0mL轉移液倒入轉移盒內，并濕潤濾紙。

C.將凝膠背面朝上置于濾紙搭成的橋上，凝膠與濾紙間避免有氣泡。

D.用保鮮紙封住凝膠四邊。

E.將浸濕的轉移膜置于凝膠的上部，凝膠與膜間避免有氣泡。

F.將剩下的3張濾紙小心的放在轉移膜的上面，并放一疊吸水紙搭在濾紙上，再放一玻璃板，其上壓一重物。

G.轉移幾小時(shí)或過(guò)夜(至少4小時(shí))

注意：勿使轉移液干枯。

7)已轉移的DNA與膜交聯(lián)

A.將膜放在浸有10 X SSC的厚濾紙上，有DNA的一面朝上。

B.將膜置于UV crosslinker 中，在紫外光下自動(dòng)交聯(lián)。

C.用蒸餾水短暫的漂洗已交聯(lián)的膜，空氣中干燥。此膜可在4℃長(cháng)期保存。

8)DNA探針的制備(略過(guò))參照生產(chǎn)商提供的實(shí)驗方法合成地高辛標記的探針。

9）印跡的預雜交將適量的預雜交液DIG Easy Hyb在42 ℃預熱。放入印跡膜，在42 ℃預雜交30min。

10)準備探針水煮地高辛標記的探針5min使變性， 并立即放在冰上2min。

11) 加適量的探針到已預熱的雜交液中，混合均勻(避免形成泡沫，影響雜交效果)。42 oC雜交至少4小時(shí)或過(guò)夜。

注意: 不要將探針直接加在印跡膜上，而應加在容器一角的預雜交液中。

12）印跡膜的沖洗：

A.將雜交液倒出，儲存起來(lái)可再次使用。

B. 用25mL的2 X SSC，0.1% SDS 在室溫搖動(dòng)洗膜2次，每次5min 。

C. 用已預熱的30mL 0.5XSSC，0.1%SDS 在65 oC搖動(dòng)洗膜2次，每次15min (用雜交爐)。

13)免疫檢測:

A. 用10mL沖洗液洗膜1-5min。

B. 膜在15mL阻斷液中孵育30min 。

C. 膜和8mL抗體孵育30min。

D. 在15mL沖洗液中洗膜2次，每次15min。

E. 在15mL檢測液中平衡2-5min。

14)將膜的有DNA的面朝上，放在保鮮紙上，滴數滴CSPD ready-to-use 覆蓋膜; 然后，立即用保鮮紙包裹， 擠掉多余的CSPD ready-to-use，使其均勻平鋪在膜上，沒(méi)有氣泡， 但避免使膜干掉. 室溫孵育5min。

15)在37 ℃孵育潮濕的膜10min，增強發(fā)光。

16)用X-光底片將雜交膜進(jìn)行曝光10-25min.(發(fā)光性能至少可持續48小時(shí))。

17) X-光底片的沖洗。Agfa 30顯影液顯影(1-5min)---沖水(1min)---F5定影液定影(10min)---用水沖洗---晾干底片。