標簽： chip 技術(shù)服務(wù) 染色質(zhì) 免疫共沉淀   

分類(lèi)： ChIP染色質(zhì)免疫沉淀

簡(jiǎn)介：ChIP的一般流程

       甲醛處理細胞---收集細胞，超聲破碎---加入目的蛋白的抗體，與靶蛋白-DNA復合物相互結合---加入ProteinA，結合抗體-靶蛋白-DNA復合物，并沉淀---對沉淀下來(lái)的復合物進(jìn)行清洗，除去一些非特異性結合---洗脫，得到富集的靶蛋白-DNA復合物---解交聯(lián)，純化富集的DNA-片斷---PCR分析。

一、細胞的甲醛交聯(lián)與超聲破碎（ 第一天）

       1. 取出1平皿細胞（10 cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的終濃度為1%（培養基共有9 ml）。

       2. 37℃孵育10 min。

       3. 終止交聯(lián)：加甘氨酸至終濃度為0.125 M。450 ul 2.5 M甘氨酸于平皿中?；靹蚝?，在室溫下放置5 min即可。

       4. 吸盡培養基，用冰冷的PBS清洗細胞2次。

       5. 細胞刮刀收集細胞于15 ml離心管中（PBS依次為5 ml，3 ml和3 ml）。預冷后2 000 rpm 5 min收集細胞。

       6. 倒去上清。按照細胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得細胞終濃度為每200ul含2×106個(gè)細胞。這樣每100 ul溶液含1×106個(gè)細胞。再加入蛋白酶抑制劑復合物。假設MCF7長(cháng)滿(mǎn)板為5×106個(gè)細胞。本次細胞長(cháng)得約為80%。即為4×106個(gè)細胞。因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。將2管混在一起，共800 ul。

       7. 超聲破碎：VCX750，25%功率，4.5 s沖擊，9 s間隙。共14次。

二、除雜及抗體哺育 （ 第一天）

       1. 超聲破碎結束后，10 000 g 4℃離心10 min。去除不溶物質(zhì)。

       2. 留取300ul做實(shí)驗，其余保存于-80℃。

       3. 300 ul中，100 ul加抗體做為實(shí)驗組；100 ul不加抗體做為對照組；100 ul加入4 ul 5 M NaCl（NaCl終濃度為0.2 M），65℃處理3 h解交聯(lián)，跑電泳，檢測超聲破碎的效果。

       4. 在100 ul的超聲破碎產(chǎn)物中，加入900 ul ChIP DilutionBuffer和20 ul的50×PIC。再各加入60 ul ProteinA Agarose/SalmonSpermDNA。4℃顛轉混勻1 h。

       5. 1 h后，在4℃靜置10 min沉淀，700 rpm離心1 min。

       6. 取上清。各留取20 ul做為input。一管中加入1 ul抗體，另一管中則不加抗體。4℃顛轉過(guò)夜。

三、檢驗超聲破碎的效果 （ 第一天）

       1. 取100 ul超聲破碎后產(chǎn)物，加入4 ul 5M NaCl，65℃處理2 h解交聯(lián)。

       2. 分出一半用酚/氯仿抽提。電泳檢測超聲效果。

四、免疫復合物的沉淀及清洗（ 第二天）

       1. 孵育過(guò)夜后，每管中加入60 ul ProteinA Agarose/SalmonSperm DNA。4℃顛轉2 h。

       2. 4℃靜置10 min后，700 rpm離心1 min。除去上清。

       3. 依次用下列溶液清洗沉淀復合物。清洗的步驟：加入溶液，在4℃顛轉10 min，4℃靜置10 min沉淀，700 rpm離心1 min，除去上清。

洗滌溶液：

      （1）low salt wash buffer-one wash

      （2）highsalt wash buffer-one wash

      （3）LiCl wash buffer-one wash

      （4）TE buffer-two wash

       4. 清洗完畢后，開(kāi)始洗脫。洗脫液的配方：100 ul 10%SDS，100 ul1M NaHCO3，800 ul ddH2O，共1 ml。每管加入250 ul洗脫buffer，室溫下顛轉15 min，靜置離心后，收集上清。重復洗滌一次。最終的洗脫液為每管500 ul。

       5. 解交聯(lián)：每管中加入20 ul 5M NaCl（NaCl終濃度為0.2 M）。

       6. 混勻，65℃解交聯(lián)過(guò)夜。

五、DNA樣品的回收（第三天）

       1. 解交聯(lián)結束后，每管加入1 ul RNaseA（MBI），37℃孵育1 h。

       2. 每管加入10 ul 0.5 M EDTA，20 ul1M Tris.HCl（PH6.5），2 ul 10 mg/ml蛋白酶K。45℃處理2 h。

       3. DNA片段的回收----omega膠回收試劑盒。最終的樣品溶于100 ul ddH2O。

六、PCR分析（第三天）

       （本文轉載丁香通）