摘要：背景：手術(shù)后持久的四肢疼痛或背部疼痛，偶爾會(huì )發(fā)展成慢性疼痛，影響許多患者的活動(dòng)和的導致較差的生活質(zhì)量。為確定引起持續性疼痛的組織病理學(xué)和病理機制，我們開(kāi)發(fā)了一個(gè)持續痛苦的疤痕動(dòng)物模型，然后檢查疼痛相關(guān)的行為和周?chē)M織的病理改變和模型的脊髓神經(jīng)。

　　方法：大鼠通過(guò)廣泛剝離后爪足底皮下組織制備動(dòng)物模型（瘢痕組），在接下來(lái)的12周檢查疼痛相關(guān)的行為。此后，我們進(jìn)行了瘢痕組織染色、免疫組化染色c-fos（L5背角），和L5脊神經(jīng)纖維/背根的電鏡分析。

　　結果：在同側足底的瘢痕動(dòng)物機械性疼痛閾值下降。這種狀態(tài)維持了12周。瘢痕組織中膠原層發(fā)現成纖維細胞呈多。發(fā)現同側神經(jīng)元的c-Fos陽(yáng)性面積、在瘢痕組和針孔背角L5水平側組（假手術(shù)）均無(wú)統計學(xué)差異。然而，破碎的髓磷脂鞘的神經(jīng)纖維被觀(guān)察到在同側L5背根的位置。

　　結論：我們通過(guò)對周?chē)M織進(jìn)行廣泛性損傷，建立了一個(gè)持續性疼痛的瘢痕模型。觀(guān)察到皮膚組織纖維化增厚，可能致敏，并對痛性瘢痕相關(guān)的脊神經(jīng)部分降解。該模型使我們能夠更好地了解疼痛性瘢痕引起的致敏機制，并探討人類(lèi)治療痛苦疤痕的新方法。

　　介紹：瘢痕形成是一個(gè)過(guò)程，是創(chuàng )傷和手術(shù)切口修復必不可少的。據報道，患瘢痕組織的難治性背痛綜合征（FBS）與周?chē)窠?jīng)功能障礙相關(guān)。脊髓減壓可普遍減輕持續性腰痛患者的疼痛。在某些情況下，疼痛仍然存在，減壓后的神經(jīng)，提示在疤痕部位的外周神經(jīng)功能障礙可能會(huì )導致慢性疼痛。也被觀(guān)察到，背部手術(shù)后運動(dòng)神經(jīng)支配與組肌萎縮，這表明，感覺(jué)神經(jīng)損傷可能發(fā)生。另一項研究報道，全髖置換術(shù)患者慢性疼痛與術(shù)中對神經(jīng)損傷有關(guān)。幾種神經(jīng)損傷的慢性疼痛的動(dòng)物模型有助于我們了解神經(jīng)性疼痛的機制。然而，由于缺乏特定的動(dòng)物模型，目前還沒(méi)有有用的方法，可以用來(lái)了解瘢痕組織的慢性疼痛的基本機制。我們開(kāi)發(fā)了一種痛性瘢痕動(dòng)物模型可以用來(lái)挑起亞急性期的可重復性和可量化的機械性痛覺(jué)過(guò)敏，持續4周。本研究的目的在12周的時(shí)間內使用這種動(dòng)物模型確定疼痛相關(guān)的疤痕組織的行為特征和探討疼痛的疤痕形成對脊髓神經(jīng)和背角神經(jīng)元的影響。本研究采用行為和免疫組化技術(shù)研究疼痛相關(guān)行為隨著(zhù)時(shí)間的推移的變化，周?chē)M織和脊髓神經(jīng)的病理改變，以及脊髓背角神經(jīng)元的致敏作用。

　　實(shí)驗動(dòng)物：使用26只雄性SD大鼠，體重150g.。動(dòng)物被飼養在塑料籠里，柔軟的墊料，自由采食和飲水。大鼠手術(shù)前至少5天適應環(huán)境， 并被分為兩組（針孔和瘢痕組）。

　　手術(shù)：所有大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（50mg/kg）。在瘢痕組（n = 13，腳有痛苦的傷痕），在左足跟用18G針扎針孔（針孔組）。疤痕組是用鋼棒在針孔處插入剝離皮下組織創(chuàng )建（= 3mm）。針孔組（為左腳，N = 13假手術(shù)），針孔是用18G針在左足跟制成（圖1）。任何動(dòng)物的右側無(wú)外科手術(shù)。

　　行為學(xué)測試：手術(shù)后，大鼠送回原來(lái)的籠子里，保持術(shù)前時(shí)期使用的相同的條件下。為了量化后爪的機械閾值，測量后腳撤退對梯度機械刺激的響應。機械刺激均采用Von Frey細絲。在測試過(guò)程中，所有大鼠被放置在一個(gè)金屬網(wǎng)地板上覆蓋一個(gè)透明的塑料圓頂（8*8*18cm）, 機械刺激作用于用von Frey細絲每只后爪敏感區。當應用時(shí)，在每個(gè)燈絲有一個(gè)輕微的彎曲以確保在每一種情況下有足夠的力。在10s內進(jìn)行連續10個(gè)Frey細絲操作，然后進(jìn)行一系列的試驗，從最薄弱的力量開(kāi)始逐漸上升。觀(guān)察到一個(gè)顯著(zhù)的撤退視為一個(gè)積極的反應，最弱的積極響應視為閾值。所有這些行為測試都在疤痕之前（0天），并每一個(gè)星期持續，直到手術(shù)后的第十二周。

　　組織學(xué)和免疫組化分析的準備：術(shù)后12周，所有大鼠給予過(guò)量異氟醚麻醉和灌注4%多聚甲醛，0.1 M磷酸緩沖液，pH值7.2，采集組織樣本，包括脊髓和雙腳。取下的組織標本重新固定在0.1 M磷酸緩沖液4%多聚甲醛，pH值7.2。為了保持樣品的形狀，組織被浸泡在從5%開(kāi)始到20%的梯度蔗糖溶液。脊髓和一半的足部樣本被迅速凍結，所有的樣品用低溫恒溫器設定切片，厚度為15微米。

　　用TBST（Tris緩沖生理鹽水含0.1%吐溫20）洗三次后，在室溫下樣品切片孵育在阻斷溶液（4%）2小時(shí)。切片再用洗滌緩沖液（0.4%阻斷劑含0.1%吐溫20）洗三次。隨后，4°C用抗c-Fos抗體孵育（1:1000）24小時(shí)。 清洗三次后，隨后與羊抗兔IgG抗體和Alexa Fluor 546在室溫下孵育2小時(shí)（1:400）。最后，洗液洗五次，加入含DAPI 的ProLong? Gold Antifad試劑封片。

　　瘢痕和針孔組的六只大鼠均采用免疫組織化學(xué)染色。每個(gè)動(dòng)物L(fēng)5水平脊髓切片。獲取所有的斷面圖像后，對c-fos陽(yáng)性神經(jīng)元進(jìn)行評價(jià)。測量同側或對側的疤痕或針孔的跖趾關(guān)節背角神經(jīng)元的蛋白表達的地區，對每只大鼠切片用反褶積熒光顯微鏡檢查，利用動(dòng)態(tài)細胞計數軟件進(jìn)行圖像分析。為分析c - Fos-IR神經(jīng)元，脊髓背角的被分為兩個(gè)部分：淺層（I-II層），和深層（III-V層）。

　　組織病理學(xué)：對足進(jìn)行石蠟包埋，切成厚度為5-10微米切片。所有的組織進(jìn)行連續切片，對左后肢足底形成的瘢痕組織進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）和Masson trichrome染色。對瘢痕和針孔組的五只大鼠進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

　　電子顯微鏡分析：立即切除L5脊神經(jīng)和脊神經(jīng)節近端，用刀片切成小塊。脊髓神經(jīng)用2%戊二醛固定，后用 1 % OsO4固定。切片用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，鏡檢。

　　結果：疼痛相關(guān)行為：用von Frey機械刺激，隨著(zhù)時(shí)間推移，產(chǎn)生的痛覺(jué)閾值見(jiàn)圖。與術(shù)前對照值進(jìn)行比較，在任何時(shí)間點(diǎn)無(wú)論是針孔組的后爪或疤痕組的后爪的對側沒(méi)有明顯的閾值的變化。但瘢痕組術(shù)后5、9、10周時(shí)同側后肢足爪退縮閾值降低。此外，與同一動(dòng)物的對側相比，手術(shù)后1，2，3，4，5，6，7，8，10，11，和12周同側（處理側）的退出閾值顯著(zhù)降低。針孔和疤痕組之間的比較表明，同側的后爪和對側的后爪在所有的手術(shù)后的時(shí)間點(diǎn)有一個(gè)下降的退縮閾值。

　　瘢痕性足底的組織病理學(xué)檢查：與針孔組相比，瘢痕組的真皮和表皮層變厚，含有較多的膠原纖維。發(fā)現膠原纖維束尺寸變化，真皮和皮下區之間的邊界不清楚。在膠原纖維之間觀(guān)察到許多具有圓形或橢圓形核的遷移細胞。與針孔組相比，疤痕組表現出真皮和皮下層的膠原纖維聚集。這些膠原纖維方向隨機。疤痕和針孔組的五只大鼠有類(lèi)似的組織學(xué)結果。

　　脊髓背角的免疫組化檢查：疤痕和針孔組之間在脊髓背角L5水平板I-II同側和對側邊的C-Fos-IR神經(jīng)元區域的蛋白表達無(wú)統計學(xué)差異。同樣，這些組之間在脊髓背角L5水平III-V層同側和對側側的C-Fos-IR神經(jīng)元地區蛋白表達無(wú)統計學(xué)差異。

　　神經(jīng)纖維的電子顯微鏡分析：對照側神經(jīng)纖維正常。沒(méi)有觀(guān)察到軸突和髓鞘的退化。軸突的質(zhì)膜與髓鞘接觸親密。與之相反，有疤痕側的神經(jīng)纖維表現出髓鞘碎片，而施旺氏鞘和軸突是完整的。軸突的質(zhì)膜與髓鞘的沒(méi)有親密接觸。

　　討論：皮膚上的一個(gè)疤痕被定義為"一個(gè)宏觀(guān)的干擾正常的結構和功能的皮膚結構，由于傷口愈合導致的"。 因此，疤痕是一種不正常的皮膚結構，是一個(gè)失敗的再生，而不是一個(gè)生物力學(xué)問(wèn)題。此外，疤痕被認為是與慢性疼痛有關(guān)的因素之一。傷口愈合處P物質(zhì)和降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）的密度增加可能與這些傷口愈合的不愉快的感覺(jué)癥狀有關(guān)。剖腹術(shù)后遭受慢性疼痛的人發(fā)現與腹膜粘連P物質(zhì)和降鈣素基因相關(guān)肽。已經(jīng)確定在同側脊髓背角有P物質(zhì)和降鈣素基因相關(guān)肽的調節。關(guān)于疤痕側腳的病理檢查顯示增生性疤痕，被認為是痛苦的。

　　幾種類(lèi)型的慢性疼痛動(dòng)物模型已被開(kāi)發(fā)和用于研究慢性疼痛機制的開(kāi)發(fā)和維護。一些慢性疼痛模型，如神經(jīng)病理性疼痛，肌肉疼痛模型，關(guān)節痛和關(guān)節固定動(dòng)物模型雙側脊髓的先前行為及免疫組化研究都顯示有痛覺(jué)過(guò)敏。在這項研究中，同側的后爪的退縮閾值低于手術(shù)前的值。同針孔組（包括同側和對側）相同的時(shí)間點(diǎn)相比，疤痕組的對側的退縮閾值下降。

　　結論：我們開(kāi)發(fā)了術(shù)后12周，疼痛疤痕、術(shù)后痛覺(jué)過(guò)敏的的動(dòng)物模型?？赡苁怯捎诔掷m的疼痛引起的中樞神經(jīng)系統的可塑性變化的結果。我們的模型能夠更好地了解疼痛的瘢痕引起的致敏機制，在未來(lái)，有助于研究治療人類(lèi)痛苦疤痕的新方法。